从造血器官中分离基质细胞

摘要

在这里，我们提出了能够从小鼠骨骼、骨髓、胸腺和人胸腺组织中分离基质细胞的方案，这些组织与单细胞多组学兼容。

摘要

单细胞测序使得造血器官基质中异质细胞群的定位成为可能。这些方法提供了一个视角，通过它来研究以前未解决的稳态异质性，以及由外在应激或衰老过程中诱导的细胞类型表示的变化。在这里，我们提出了从小鼠和人胸腺以及小鼠骨骼和骨髓中分离高质量基质细胞群的逐步方案。通过这些方案分离的细胞适用于生成高质量的单细胞多组学数据集。本文将讨论样本消化、造血谱系耗竭、FACS分析/分选的影响，以及这些因素如何影响与单细胞测序的兼容性。通过FACS谱的示例，表明测序后分析中成功和低效的解离以及下游基质细胞产量，为用户提供了可识别的指针。考虑基质细胞的特定要求对于获得高质量和可重复的结果至关重要，这些结果可以推动该领域的知识发展。

引言

在健康的成年人中，血细胞的从头产生发生在骨髓和胸腺中。这些部位的基质细胞对于维持造血至关重要，但基质^{占组织的不到} 1^%，2,3,4。因此，获得支持基质的造血干细胞的纯分离株是一个重大挑战，特别是对于单细胞多组学而言，需要权宜之计才能获得高质量的样本。不同消化混合物的成分可能会干扰多组学分析中的某些步骤^5,6。本文介绍的方案详细介绍了从骨髓和胸腺组织中分离出多种基质细胞的方法。

骨髓和胸腺中基质成分的扰动会导致血细胞发育的严重破坏，并可能导致恶性肿瘤 ^7,8,9。在细胞毒性调理和骨髓移植后，支持基质的造血功能受到损害，导致维持造血干细胞和祖细胞 （HSPC） 的细胞因子和生长因子的分泌减少2,10,11。

研究方案

所有与人体组织有关的工作都是在马萨诸塞州总医院内部审查委员会 （IRB） 批准后进行的。所有动物程序均按照马萨诸塞州总医院机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 指南进行。本研究采用C57Bl/6只小鼠，年龄8-10周龄，雄性和雌性均为小鼠。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。

1.鼠胸腺组织的制备

1. 准备以下缓冲液和溶液。
   1. 培养基 199 （M199） 与 2% （v/v） 胎牛血清 （FBS）（参见 材料表）。
   2. 小鼠解离混合物：0.5 WU/mL Liberase TM 和 6.3 U/mL DNase I，M199 + 2% FBS（参见 材料表）。
   3. M199 含 2% （w/v） 牛血清白蛋白 （BSA）。
      注意：含有FBS的培养基可以切换到BSA以提高RNA质量。
2. 进行小鼠胸腺解剖
   1. 通过 CO₂ 窒息对小鼠实施安乐死（遵循机构批准的方案）并将其放在背上。通过喷洒 70% 乙醇弄湿胸部的毛发，然后继续打开胸腔。
   2. 首先用手术剪刀在肋骨下方做一个横向切口，小心地解剖胸腺。切开小鼠两侧的肋骨，一直切到锁骨。然后切开横膈膜，使胸壁可以释放。用一把镊子提起....

讨论

造血器官中的基质细胞对于正常造血至关重要，而造血基质扰动可导致造血维持和对应激反应的严重损害 ^9,23,24。深入了解造血基质细胞对于理解血液疾病至关重要 7,9,10,24 以及开发对抗它们的治疗方法的能力 ^25,26

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200-072
7AAD (7-aminoactinomycin D)	BD Biosciences	559925
Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC	BD Biosciences	643510
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9647
C57Bl/6 mice	Jackson	664	Males or females, 8-12 weeks old
Calcein	Fisher Scientific	65-0853-78
Collagenase IV	Millipore Sigma	C5138
Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µm	Fisher Scientific	08-771-2
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Biolegend	422801
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Dnase I Solution	Thermo Fisher Scientific	90083	2500 U/mL
Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kit	StemCell Technologies	19860
Fetal Bovine Serum	Gibco	A31605-01	Qualified One Shot
Human Fc Block	BD Biosciences	564220
Liberase TM	Millipore Sigma	5401127001	Research Grade
Medium 199	Gibco	12350
Mouse anti-human CD235a-BV77	BD Biosciences	740785
Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594	Biolegend	303130
Mouse anti-human CD45-BV77	Biolegend	304050
Mouse anti-human CD4-BV605	BD Biosciences	562658
Mouse anti-human CD66b-FITC	BD Biosciences	555724
Mouse anti-human CD8-APC/Cy7	BD Biosciences	557760
Mouse anti-human EpCam-BV421	Biolegend	324220
Protector RNase Inhibitor	Millipore Sigma	3335402001
Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594	Biolegend	120424
Rat anti-mouse CD11b-Biotin	Biolegend	101204
Rat anti-mouse CD140a-APC	Fisher Scientific	17-1401-81
Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553142
Rat anti-mouse CD31-BUV737	BD Biosciences	612802
Rat anti-mouse CD31-BV421	Biolegend	102424
Rat anti-mouse CD3-Biotin	Biolegend	100244
Rat anti-mouse CD45.2-Biotin	Biolegend	109804
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7	Biolegend	103114
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7	Biolegend	103114
Rat anti-mouse CD45R/B220-Biotin	Biolegend	103204
Rat anti-mouse CD51-PE	Biolegend	104106
Rat anti-mouse EpCam-BV711	BD Biosciences	563134
Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700	Biolegend	108142
Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin	Biolegend	108404
Rat anti-mouse Ter119-Biotin	Biolegend	116204
Rat anti-mouse Ter119-PE	Biolegend	116208
Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7	Biolegend	116222
Stemxyme	Worthington Biochemical	LS004107