在水培条件下测量 拟南芥 根上的细菌定植

摘要

植物促生长根际（PGPR）在根际的定植对其促生长作用至关重要。有必要规范细菌根际定植的检测方法。在这里，我们描述了一种可重复的方法，用于量化细菌在根表面的定植。

摘要

测量 拟南芥 根上的细菌定植是植物-微生物相互作用研究中最常见的实验之一。为了提高可重复性，需要一种标准化的方法来测量细菌在根际中的定植。我们首先在水培条件下培养无菌 拟南芥 ，然后在根际中以 OD₆₀₀ 的终浓度 0.01 接种细菌细胞。接种后 2 天，收获根组织并在无菌水中洗涤 3 次，以去除未定植的细菌细胞。然后称重根部，并通过涡旋收集定植在根部上的细菌细胞。用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 缓冲液以梯度稀释细胞悬液，然后接种到 Luria-Bertani （LB） 琼脂培养基上。将平板在37°C下孵育10小时，然后对LB平板上的单个菌落进行计数并归一化，以指示定植在根上的细菌细胞。该方法用于在单相互作用条件下检测细菌在根际中的定植，具有良好的重现性。

引言

有定量和定性方法可用于检测单一细菌菌株的根际定植。对于定性方法，应使用组成型表达荧光的菌株，并且应在荧光显微镜或激光共^{聚焦仪器1,2}下检查荧光分布和强度。这些策略可以很好地反映细菌原位定植 ³，但它们在定量方面不如传统的平板计数方法准确。此外，由于在显微镜下只能显示部分根区的限制，有时可能会受到主观偏见的影响。

在这里，我们描述了一种定量方法，其中包括收集定植的细菌细胞并计数板上的细菌 CFU。该方法基于稀释和铺板，通过该方法可以计算从植物根部剥离的定植菌株，^{并且可以计算出}根部上的总定植细菌数^4,5。

首先，在水培条件下培养 拟南芥 ，然后在根际中以终浓度0.01 OD₆₀₀接种细菌细胞。接种后 2 天收获感染的根组织，并用无菌水洗涤以去除未定植的细菌细胞。此外，收集定植在根上的细菌细胞，在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 缓冲液中稀释，并接种到 Luria-Bertani （LB） 琼脂培养基上。在37°C孵育10小时后，对LB平板上的单个菌落进行计数并归一化以确定定植在根上的细菌细胞。<....

研究方案

1.无菌水培拟南芥栽培

1. 准备 拟南芥 幼苗。
   1. 准备培养 拟南芥 幼苗培养基，其由1/2MS培养基（Murashige和Skoog）与2%（wt / vol）蔗糖和0.9%（wt / vol）琼脂组成。
   2. 在凝固之前，将准备好的灭菌培养基倒入无菌方形培养皿（13 cm x 13 cm）中。避免风干以保持湿度。
   3. 将 拟南芥 种子浸入装有1mL无菌水的2mL微量离心管中，在4°C下浸泡12小时以上，然后用1mL 2%（体积/体积）NaClO灭菌种子2分钟。
   4. 用无菌水彻底清洗种子六次，以去除NaClO溶液。用 MS 琼脂培养基将种子播种在培养皿上，吸头为无菌 1 mL。
   5. 用透气的医用胶带密封培养皿，并将它们垂直放置在光照培养箱中生长 1 周。将光照培养箱昼夜比设置为16小时/ 8小时，保持温度为23°C，湿度为40%-60%。
2. 移植拟 南芥。
   1. 在 40 μm 孔径细胞染色剂上切 5 mm 孔并无菌。
   2. 通过细胞过滤器的孔移植三株 7 天大的 拟南芥 植物，并将它们放入含有 3 mL 无菌液体 1/2 MS 培养基和 0.5% 蔗糖的 6 孔板中。
   3. 将....

讨论

为了实现良好的可重复性，该协议的定植检测过程有四个关键步骤。首先，必须确保每个实验中接种的细菌细胞数量完全相同。其次，用无菌水控制未定植的细菌清洁强度也是必要的。第三，每个样品稀释过程在进行之前都需要进行涡旋，以使样品处于完全混合状态，以避免由于细菌的特性而导致的吸收误差，这些特性容易在微量离心管中下沉。因此，我们建议在每次吸收前使用涡旋仪混合细菌?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Corning	3516
Filter cell stainer	Solarbio	F8200-40µm
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO
Murashige and Skoog medium	Hopebio	HB8469-5
NaClO	Alfa	L14709
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Square petri dish	Ruiai Zhengte	PYM-130
Vortex Genie2	Scientific Industries	G560E