通过使用 邻苯二甲醛 (OPA) 实现了氧化型和还原型谷胱甘肽(分别为 GSSG 和 GSH)的定量。OPA一旦与GSH偶联,就会变得高度荧光,但在还原之前无法与GSSG偶联。在这里,我们描述了一种多参数测定法,以使用蛋白质定量进行归一化来量化两者。
谷胱甘肽长期以来一直被认为是确定细胞抗氧化反应的关键生物标志物。因此,它是活性氧研究的主要标志物。该方法利用 邻苯二甲醛 (OPA) 来量化谷胱甘肽的细胞浓度。OPA通过巯基结合与还原型谷胱甘肽(GSH)偶联,随后形成异吲哚,产生高荧光偶联物。为了获得氧化谷胱甘肽(GSSG)和GSH的准确结果,需要在本协议中实施的掩蔽剂和还原剂的组合。治疗也可能影响细胞活力。因此,在这种多参数测定中提出了通过蛋白质测定的归一化。该测定表明,对 GSH 具有特异性的伪线性检测范围为 0.234 - 30μM (R2=0.9932±0.007 (N=12))。所提出的测定方法还允许通过添加掩蔽剂N-乙基马来酰亚胺结合还原型谷胱甘肽来测定氧化型谷胱甘肽,并引入还原剂三(2-羧乙基)膦来切割GSSG中的二硫键以产生两个分子的GSH。该测定与经过验证的二辛可宁酸测定法结合使用,用于蛋白质定量,与腺苷酸激酶测定法结合使用,用于细胞毒性评估。
活性氧(ROS)是氧化应激的主要诱导剂;氧化应激在 DNA 突变、细胞衰老/死亡、各种癌症、糖尿病、神经系统疾病(如帕金森氏症和阿尔茨海默氏症)以及其他几种使人衰弱的疾病中已经得到充分证实 1,2,3,4,5。对抗 ROS 的关键防御是硫醇、非酶促抗氧化剂,它们能够通过充当质子供体来减少氧化剂或自由基 6,7。谷胱甘肽 (GSH) 和半胱氨酸是在哺乳动物中发现的两种最普遍的硫醇8,而存在各种其他低分子量硫醇(如麦角硫因)、GSH 和半胱氨酸是文献9、10、11 中发现的最常测量的非酶促抗氧化剂,与对抗 ROS 最相关 8,12,13,14。
当 GSH 用作抗氧化剂时,两个 GSH 分子通过二硫键共价连接在一起,形成谷胱甘肽二硫化物 (GSSG)。谷胱甘肽的消耗通常被用作氧化应激的指标15,16。该评估也可以与 GSSG 的检测相结合,尽管细胞中 GSSG 的增加通常受到活性输出过程的限制,因为 GSSG 在细胞中可能相对具有反应性,导致与其他蛋白硫醇形成二硫键16。
测量 GSH 和 GSSG 的传统方法不是简单的过程,需要许多步骤,包括使用裂解试剂进行细胞提取17,18。这里概述的方案简化了这些方法,并允许准确测量非酶促硫醇和使用细胞蛋白含量或腺苷酸激酶释放进行归一化。此外,还可以在 GSH/GSSG 提取之前测量细胞活力。以前有几种方法试图有效地靶向和定量还原和氧化的非酶促硫醇;方法包括使用HPLC 19,20,21,平板测定(生化)22,23,24,25,以及使用常用试剂进行硫醇偶联,如5,5-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB/Ellman试剂)19,一氯二鳃(mBCI)26,27,28 .几家公司还准备了用于检测谷胱甘肽的专有试剂盒;然而,他们没有公布试剂不相容性,这会带来取决于所用处理方法的问题29.
该协议概述了一种多参数测定法,该测定法通过 邻苯二甲醛(OPA)偶联检测还原硫醇(如GSH),以产生分别在340/450 Ex / Em下可检测的荧光信号。该测定通过使用掩蔽剂(N-乙基马来酰亚胺)和GSSG还原剂(三(2-羧乙基)膦)同时(在板中)检测GSH和GSSG。这种多生物标志物方案还为细胞裂解阶段提供了一个机会,通过二辛可宁酸测定法定量蛋白质,以便在完成最终测量时对样品进行归一化,或通过细胞培养基中的腺苷酸激酶测定法进行量化。该测定可以使用大多数实验室中现成的几种试剂进行,并且只需要一些额外的不常见化学品即可进行。该过程简单易行,并且可以在不到 2 小时的时间内完成而无需费力的阶段。
在该方案中,选择了各种纳米材料,这些纳米材料先前被证明可以诱导ROS或怀疑可以诱导氧化应激30,31。探索了一个浓度范围,以观察这些纳米材料暴露对各种细胞系的影响,以及该测定在量化抗氧化剂硫醇方面的有效性。
注:以下方案的设计具有与二辛可宁酸(BCA)蛋白测定和腺苷酸激酶(AK)测定结合使用的能力,以使样品标准化为治疗。在整个材料的准备和使用过程中,确保操作员穿着适当的服装和必要的安全设备,例如 Howie 实验室外套、丁腈手套和 I 类安全眼镜。该协议分为几个阶段。
1. 储备液和工作溶液的制备
2. 测定制备
注:该协议使用人类细胞系HepG2,A549和J774,这些细胞系是从ATCC商业购买的。这些细胞系是根据大学的动物和组织培养法案和条例制定的批准指南使用的。
细胞系 | 接种密度(96孔板) |
HepG2 | 10,000 个细胞/孔 |
空客A549 | 5,000 个细胞/孔 |
J774型 | 10,000 个细胞/孔 |
表 1:所选细胞系的建议接种密度。 演示了表示数据中使用的三种不同细胞系的不同接种密度,特别是 A549、J774 和 HepG2。
图 1:用于同时测定总谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫化物的 96 孔板接种的拟议布局。 此外,还演示了用于校准和控制的孔。未使用的井用十字表示。 请点击这里查看此图的较大版本.
3.纳米材料处理
4. 检测方案
总谷胱甘肽浓度裂解试剂混合物 | |
元件 | 卷 |
裂解缓冲液 | 50微升 |
总体积/孔 | 50微升 |
氧化谷胱甘肽浓度裂解试剂混合物 | |
元件 | 卷 |
裂解缓冲液 | 49.5微升 |
NEM(25毫米) | 0.5微升 |
总体积/孔 | 50微升 |
在混合物组成后 30 分钟内使用两种溶液 | |
OPA检测解决方案组件 | 卷 |
OPA 3毫克/毫升 | 5微升 |
PBS (pH 9.0) | 165微升 |
总体积/孔 | 170微升 |
表 2:执行方案所需的试剂体积。 测定总谷胱甘肽、谷胱甘肽二硫化物和所需工作试剂所需的每孔体积。确保计算所需的体积,并包含超额,以说明传输过程中的体积损失。
图 2:协议的示意图。 (A) 细胞的初始接种、孵育和处理。(B) 离心以将培养基与悬浮固体分离。(C) 腺苷酸激酶测定的培养基转移。(D) 添加谷胱甘肽浓度用于校准范围。(E) 洗涤阶段和裂解试剂添加。(F)缓冲液加入和三(2-羧乙基)膦加入与振荡步骤。(G) 离心裂解细胞以去除培养基以进行蛋白质分析。(H) 去除介质以平衡整个板的体积。(I) 邻苯二甲醛工作溶液的加入,振荡孵育。(J) 通过酶标仪测量 邻苯二甲醛荧光。(K) 用于蛋白质测定的二辛可宁酸测定的孵育阶段。(L) 测量蛋白质浓度,使谷胱甘肽标准化:谷胱甘肽二硫化物值。 请点击这里查看此图的较大版本.
按照该方案,分别以5,000个细胞/孔和10,000个细胞/孔的密度接种A549和J774细胞系,并在37°C的5%CO2 中培养48小时。纳米材料处理后的AK分析见 附表1,蛋白质浓度见 补充表2。
校准图表
图3所示的是使用规定浓度范围(0.234 - 30μM终浓度)从三种不同细胞类型的三个独立板进行的三次校准(尽管不应影响校准),在三个不同的非连续天。虽然显示了 3 个样本,但观察到 N 为 12,并表现出相似的线性回归,平均 R2 值为 0.9932 ± 0.007。
图 3:用于测定的谷胱甘肽校准图。 来自不同板内谷胱甘肽校准范围的三个校准图,每个校准图相隔一周进行;误差线 ± SD (n=3, N=12) n=技术重复,N=生物重复。 请点击这里查看此图的较大版本.
示例结果
HepG2、A549 和 J774 细胞用于评估各种纳米材料,这些纳米材料涉嫌通过氧化应激诱导细胞机制的变化。使用了所描述的检测和定量方案。
从 3 次测量(AK、BCA 和 GSH/GSSG)接收的数据处理如下。实施 AK 和 BCA 测定以实现标准化;使用推荐试剂盒的 AK 测定将提供释放到细胞培养基中的 AK 量的最快、最简单的数据。预计 AK 值的增加会增加细胞死亡。因此,需要 -ve(Alive)和 +ve(Dead)控件。这将允许基于百分比进行规范化。
BCA测定是一个较长的过程,但允许通过蛋白质定量(mg/mL)获得可量化的结果。这不需要像 AK 中那样的 -ve 或 +ve 控件,但仍需要通用的 -ve 控件(未处理的单元格)以实现值的归一化。
在这个具有代表性的结果部分中,发现处理(纳米材料)有可能对AK测定造成干扰。因此,所有归一化都是使用 BCA 数据执行的。因此,信息以每 mg/mL 蛋白质(通过 BCA 测定)的检测物种(GSH 或 GSH+GSSG(然而,从总 GSH+GSSG 浓度中减去 GSH 浓度以获得 GSSG 浓度)的浓度表示。如果需要,可以将其转换为比率,以评估所需处理后 GSH:GSSG 的变化。
图 4 中显示的是使用 OPA 方案获取的三种不同细胞系(A549、J774 和 HepG2)的 GSH:GSSG 比率数据,并通过 BCA 归一化为蛋白质表达 (μg/mL),指定额外 GSH 和 GSSG 值的进一步数据可在补充图 1 中找到。
图 4:谷胱甘肽:谷胱甘肽二硫化物比率。 图中所示为3种细胞系的谷胱甘肽:谷胱甘肽二硫化物比率,即(A)A549、(B)J774和(C)HepG2。将细胞与处理物(无血清培养基中的各种纳米材料)一起孵育 4 小时。使用此方案处理细胞以量化谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫化物的变化,并通过蛋白质定量、误差线± SE (n = 3, N=3) 进行归一化 请单击此处查看此图的较大版本.
该板还包含一系列对照品,以确保检测正确运行。NEM 作为单独的组件添加,以证明缺乏与 OPA 检测介质的交互。校准标准品表明,GSH浓度呈线性增加,这表明OPA检测试剂有效结合浓度增加的GSH浓度。
必须注意的是,该测定专门针对硫醇中常见的游离巯基(例如GSH,通常被认为是抗氧化剂)。一种可能的相互作用是OPA与蛋白质硫醇的结合,这将导致不准确的数据收集。因此,BCA测定是将数据归一化为蛋白质并允许准确反映游离GSH的关键阶段。
补充图1: 显示 3 种细胞系(即 (A) A549、(B) J774 和 (C) HepG2 的谷胱甘肽、谷胱甘肽二硫化物和谷胱甘肽:谷胱甘肽二硫化物比率的图表。将细胞与处理物(无血清培养基中的各种纳米材料)一起孵育 4 小时。使用此方案处理细胞以量化谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫化物的变化,并通过蛋白质定量、误差线± SE (n = 3, N=3) 进行归一化 请单击此处下载此文件。
附表1: A549 和 J774 细胞腺苷酸激酶值的元数据。 请点击这里下载此文件。
附表2: 校准 A549、J774 和 HepG2 细胞的二辛可宁酸值的元数据。 请点击这里下载此文件。
如前所述,了解细胞氧化还原、监测氧化应激状态和抗氧化反应对于理解和预防癌症和神经退行性疾病(如癌症和神经退行性疾病)一直至关重要33,34。本文展示了一种通过提高准确 GSH 的可及性来改善转化环境的方法:GSSG 检测具有快速、最少的准备工作。
该方案展示了用于测定细胞内谷胱甘肽/硫醇种类(还原和氧化)的多参数测定序列,具有通过BCA蛋白测定和/或AK测定的2种归一化方法。该测定法也可以通过初始介质提取步骤进行修改以检测各种其他标记物,并且可以以一种方式进行简化,即简单地给出氧化/还原硫醇比率,而不排除校准范围。
在考虑分析物的评估时,对 mBCI 和 OPA 进行了探索和比较。虽然 mBCl 最初表现出良好的信号潜力,但发现使用上存在重大局限性。首先,使用活细胞证明了 mBCl 的最佳利用;然而,在细胞裂解后,发现信号被淬灭,与 OPA35 相比,信号通常以多孔形式减弱。另一个问题是通过mBCl测量GSSG,关于这一点的文献很少,通过协议优化/探索,没有实现通过mBCl准确检测GSSG。
我们已经证明,OPA 测定具有非常可靠的校准范围,在 0.234 - 30 μM GSH 浓度范围内,R2 平均值为 0.9932 ± 0.007 (N=12)。之所以选择这个范围,是因为在文献35中发现了以前的参考范围。从理论上讲,可以在这些范围之外检测到谷胱甘肽,但需要修改试剂浓度、孵育时间以及可能用于检测的设备。必须注意的是,每个板都需要有自己的定量标准范围;在不同日期进行的板之间最微小的时间差异会对测量过程中获得的值产生重大影响。
从该协议中获得准确可靠的数据取决于严格遵守的几个关键步骤。在构建方案中所需的各种缓冲液时,pH值的准确性至关重要。因此,要求 pH 值为 9 的缓冲液的偏差不应超过 ± 0.1。这是由于缓冲液组分可能在错误的pH值下从溶液中沉淀出来;完全遵循此协议将防止此问题。
在裂解前完全去除处理和准确洗涤对于防止在孔板读数阶段出现伪影和不准确的数据采集也至关重要。一旦细胞被裂解(步骤4.8),就不可能去除处理物,并且板将无法挽救。由于在整个方案中添加的缓冲液/试剂的体积在样品和标准品之间有所不同,因此在步骤4.12和4.13中,用户了解不同的体积至关重要。此外,检测操作人员还需要了解这些不同的体积,并指示他们确保所有体积都相同,以便实现准确的测量。由于样品和标准品之间的体积并不明显,因此在样品孔中含有过量溶液时,很容易犯错误。
该协议存在一些局限性,这些限制依赖于关键步骤,而这些步骤对于获取准确可靠的数据至关重要。执行此测定的用户需要具备合理水平的实验室技能,以防止出现不必要的问题,例如气泡形成。气泡的形成对微孔板内发生反应的能力和荧光的测量都有巨大的影响。该协议中使用的裂解剂含有去污剂,这给可能难以防止气泡形成的新手研究人员带来了困难。立即离心可以挽救这种误差。该协议在细胞类型方面也可能受到限制;细胞系 A549、J774 和 HepG2 用于优化和生成该协议的数据。其他细胞系可能需要不同的接种密度和方案的优化才能获得准确的数据。
与几种现有的测定相比,该协议具有许多优势。虽然使用邻苯二甲醛检测硫醇并不是一个新概念,但在像这样的组合测定形式中,在微孔板中使用所需的材料和设备,为所有实验室使用该协议提供了巨大的潜力。大多数来自商业供应商的硫醇/谷胱甘肽试剂盒不披露其试剂的成分。因此,可能很难预见到不兼容/干扰的可能性。在这里,我们介绍了所有使用的试剂的每个组成部分,以限制这种潜力。
在初始治疗期完成后,该方案也相当迅速地执行。考虑到孵育阶段之间的用户处理,该协议的硫醇定量方面可以在1小时内进行。样品同时裂解和结合,以防止样品的自氧化,这对于这些反应物种来说是最佳的。虽然方案中没有指定,但从技术上讲,样品可以在板中裂解并密封,从而可以冷冻以备将来分析。然而,对协议的这种改变尚未得到探索。
作者声明没有利益冲突。
这项研究由欧洲项目GRACIOUS (GA760840)和SUNSHINE (GA952924)资助。作者还要感谢所有以某种方式协助制定该议定书的人的努力。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22µm filter (optional-For lysis buffer) | Fisher scientific | 12561259 | |
100mL volumetric flask | Fisher scientific | 15290866 | |
1L Volumetric flask | Fisher scientific | 15230876 | |
250mL beaker (optional-For lysis buffer) | Fisher scientific | 15409083 | |
8-Channel micropipette (20-200µL) | SLS | FA10011D2 | |
8-Channel micropipette (2-20µL) | SLS | B2B06492 | |
96 well plates - black with clear bottom, TC treated | Fisher scientific | 10000631 | Preferred plate for seeding and fluoresence, use TC treated clear if unavailable |
96 well plates - clear (TC treated and untreated) | Fisher scientific | 10141161 | If black plates with clear bottom is not available/ suitable use TC treated clear |
96 well plates - white, Not TC treated | Fisher scientific | 11457009 | |
A549 (lung carcinoma) cell line | ATCC | CCL-185 | |
Absolute ethanol | Merck (Sigma-Aldrich) | 1.08543 | |
Aluminium foil | Fisher scientific | 11779408 | For protecting plates from light |
BCA Assay Kit | Thermo | 23225 | |
Benchtop Centrifuge (with 96 plate rotor) | Eppendorf | 5804 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck (Sigma-Aldrich) | E9884 | |
Glutathione (GSH) | Merck (Sigma-Aldrich) | G6013 | |
Glutathione disulfide (GSSG) | Merck (Sigma-Aldrich) | G4501 | |
Glycerol | Merck (Sigma-Aldrich) | G5516 | |
HCl, 37% | Merck (Sigma-Aldrich) | 258148 | Dilute to 1mM for GSH stock, pH adjustment also |
HepG2 (Hepatocarcinoma) cell line | ATCC | HB-8065 | |
IGEPAL CA-630 | Merck (Sigma-Aldrich) | 18896 | Use either IGEPAL CA-630 or NP-40 for solution, not both |
IP lysis buffer | Fisher scientific | 11825135 | |
J774 (monocyte, macrophage) cell line | ATCC | TIB-67 | |
KCl | Merck (Sigma-Aldrich) | P3911 | |
KH2PO4 | Merck (Sigma-Aldrich) | P0662 | |
Micropipette (20-200µL) | SLS | B2B06482 | |
Micropipette (2-20µL) | SLS | B2B06478 | |
Microplate shaker | VWR | 444-0041 | |
Na2HPO4 | Merck (Sigma-Aldrich) | S9763 | |
NaCl | Merck (Sigma-Aldrich) | S9888 | |
NaOH, 10M | Merck (Sigma-Aldrich) | 72068 | For pH adjustment only |
N-Ethylmaleimide (NEM) | Merck (Sigma-Aldrich) | E3876 | |
NP-40 | Merck (Sigma-Aldrich) | 492016 | Use either IGEPAL CA-630 or NP-40 for solution, not both. NP-40 alternative suggested |
Ortho -Phthaldialdehyde (OPA) | Merck (Sigma-Aldrich) | P1378 | |
PBS 0.1M | Merck (Sigma-Aldrich) | P2272 | PBS can either be acquired pre-made or made in house, see notes |
Plate reader (with fluoresence capacity) | Tecan | SPARK | |
Stir bar (optional-For lysis buffer) | Fisher scientific | 16265731 | |
Toxilight bioassay kit (AK assay) | Lonza | LT17-217 | |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) 0.5M in H2O | Alfa Aesar | H51864 | Can also be purchased crystalised and suspended |
TRIS-HCl | Merck (Sigma-Aldrich) | 93363 | |
X100 phosphatase and protease cocktail | Fisher scientific | 10025743 |
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