使用 FRET估计活细胞中响应高渗应激的固有无序区域的结构敏感性

摘要

内在无序区域 （IDR） 是灵活的蛋白质结构域，可根据环境变化改变其构象。集成荧光共振能量转移（FRET）可以估计不同条件下的蛋白质尺寸。我们提出了一种FRET方法来评估高渗胁迫下酿酒 酵 母活细胞的IDR结构敏感性。

摘要

内在无序区域 （IDR） 是参与关键细胞过程的蛋白质结构域。在应激条件下，细胞环境的物理化学性质发生变化，直接影响IDR的构象集合。IDR本身就对环境扰动敏感。研究细胞的物理化学特性如何调节IDR的构象集合对于理解其功能的环境控制至关重要。在这里，我们描述了一种分步方法，用于测量活 酿酒酵 母细胞中IDR对高渗胁迫条件的响应的结构敏感性。我们介绍了使用集成荧光共振能量转移 （FRET） 来估计 IDR 的全局维度在施加于任何渗透压的细胞的高渗应力逐渐增加期间如何变化。此外，我们还提供了一个脚本，用于处理荧光测量和比较不同IDR的结构灵敏度。通过遵循这种方法，研究人员可以获得对IDR在复杂的细胞内环境中不断变化的环境所经历的构象变化的宝贵见解。

引言

固有无序区域 （IDR） 是细胞过程中的关键组成部分¹。IDR与结构结构域相结合，对蛋白质功能至关重要。IDRs的氨基酸组成是有偏差的，主要由带电的、亲水的和小残基表示。由于这一特性，IDR 被认为是低复杂度域 ^2,3。许多IDR引起了人们的关注，主要是因为这些区域在病理状况中起着至关重要的作用，尤其是神经退行性疾病。此类疾病的特征是神经元中 IDR 的自组装和随后的细胞外或细胞内沉积⁴。此类 IDR 的例子包括阿尔茨海默病中的淀粉样蛋白 β （Aβ）、亨廷顿病中的亨廷顿蛋白 （HTT） 以及肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆的 TAR DNA 结合蛋白-43 和肉瘤融合蛋白 （FUS）⁴。包括荧光共振能量转移 （FRET） 在内的光谱方法显着增强了对疾病背景下 IDR 结构重排的研究。

IDR的亲水性和扩展性使其对溶液环境的理化性质变化极为敏感⁵。IDR的构象集合被环境改变的程度称为结构敏感性^5,6,7....

研究方案

1. 质粒构建体

1. 通过聚合酶链反应 （PCR） 扩增编码所需 IDR 的开放阅读框 （ORF）。不要包括终止密码子，因为ORF的两侧是编码荧光蛋白的基因。对于扩增，设计具有 SacI （5'） 和 BglII （3'） 限制性位点的引物。
   注意：对于代表性结果部分，我们使用 AtLEA4-5 作为选定的 IDR。我们从 pTrc99A-AtLEA4-5 质粒¹² 扩增了 AtLEA4-5 的 ORF。
2. 通过用 SacI 和 BglII 酶连续限制来消化 ORF PCR 产物¹³。
3. 从 Addgene （https://www.addgene.org/178189/） 获得商业质粒 pDRFLIP38-AtLEA4-5 （#178189）。
4. 使用 SacI 和 BglII 酶进行连续限制，以从 pDRFLIP38-AtLEA4-5 质粒中去除 AtLEA4-5 ORF，留下含有 FRET 对¹³ 的开放质粒。
5. 使用琼脂糖凝胶电泳中的凝胶回收¹⁴纯化消化的DNA片段。使用 DNA 连接酶

讨论

这里介绍的方法提供了一种方法来深入了解IDR集合的全局维度如何感知和响应环境扰动。该方法依赖于基因编码的构建体，除了酵母细胞中的质粒稳定表达外，不需要其他成分，使其适用于其他细胞类型的潜在应用。此外，它可用于探索真核细胞在其生命周期中经历的其他物理化学扰动²¹.FRET的分辨率是显着的，能量转移仅发生在供体和受体FP之间小于10nm的范围内。然而，主要的.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Greiner Bio-One	655096
Agar	Sigma-Aldrich	5040
BglII	New England BioLabs	R0144S
BJ5465 cells	American Type Culture Collection	208289
Buffer MES 50 mM	Sigma-Aldrich	M8250
Buffer Tris-HCl 10 mM	Invitrogen	15506017
EDTA 1 mM	Merck	108452
Falcon tubes	Corning	352057
LB media	Sigma-Aldrich	L2897
Lithium acetate 0.1 M	Sigma-Aldrich	L6883
Low Melt Agarose	GOLDBIO	A-204-25
Microcentrifuge	eppendorf	5452000010
Miniprep kit	ZymoPure	D4210
NaOH 0.02 M	Merck	106462
PEG 3,350 40%	Sigma-Aldrich	1546547
plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5	addgene	178189
Plate reader	BMG LABTECH	CLARIOstar Plus
SacI	New England BioLabs	R3156S
Salmon sperm DNA 2 mg/mL	Thermo Fisher Scientific	15632011
SD-Ura	Sigma-Aldrich	Y1501
Sodium cloride	Sigma-Aldrich	S9888
Taq polymesare	Promega	M5123
Transiluminator	Accuris instruments	E4000
UV-Visible spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Biomate3
YPD media	Sigma-Aldrich	Y1500