小鼠模型中胶质母细胞瘤的双光子活体显微镜

摘要

我们提出了一种在小鼠模型中将荧光标记的氧化铁纳米颗粒递送至胶质母细胞瘤的双光子显微镜的新方法。

摘要

静脉注射癌症治疗药物对脑肿瘤的递送受到血脑屏障的限制。一种在 体内 直接成像脑肿瘤中大分子积累和分布的方法将大大提高我们在临床前模型中理解和优化药物递送的能力。该协议描述了一种在胶质母细胞瘤（GBM）小鼠模型中使用双光子活体显微镜（2P-IVM）对静脉内施用的荧光标记纳米颗粒进行实时 体内 跟踪的方法。

该协议包含对程序的多步骤描述，包括实验动物的麻醉和镇痛、创建颅窗、GBM 细胞植入、放置头杆、进行 2P-IVM 研究以及长期随访研究的术后护理。我们展示了具有代表性的2P-IVM成像会议和图像分析，研究了该技术的优缺点，并讨论了潜在的应用。

该方法可以很容易地修改和适应 体内 临床前脑成像领域的不同研究问题。

引言

双光子活体显微镜 （2P-IVM） 是一种荧光成像技术，可实现活组织¹ 的可视化。

2P-IVM 于 1990 年代首次开发，已用于视网膜²、肾脏³、小肠⁴、耳蜗⁵、心脏⁶、气管^{7 和各种}临床前模型^的大脑的体内分析 ^8,9。在神经科学领域，2P-IVM 作为一种对清醒动物健康大脑进行实时成像的技术¹⁰ 以及研究神经系统疾病（如阿尔茨海默氏症¹¹、帕金森氏症¹² 和胶质母细胞瘤 （GBM）^{13、14、15、16....}

研究方案

本协议中描述的动物程序符合实验动物护理管理小组 （APLAC） 的要求。

1. 细胞培养

1. 罩子的准备
   1. 洗手，戴手套和实验室外套。打开生物安全柜并将窗扇水平设置为适当的打开高度。让抽油烟机吹扫 3-5 分钟。用 70% 乙醇喷洒引擎盖区域，然后用纸巾擦拭。
   2. 用70%乙醇喷洒所有试剂，并用薄纸擦拭。将试剂移入罩中。不要在烤架上放任何物品。如果引擎盖发生溢出，请用湿巾盖住，喷上 70% 乙醇，然后再次擦拭。
   3. 实验结束后，小心地盖上每件物品的盖子，擦拭所有材料，从抽油烟机中取出任何物品，并将它们转移到原来的位置。在抽油烟机中喷洒 70% 乙醇并擦拭。关闭窗扇并关闭生物安全柜。
2. 生长培养基的制备
   1. 将 50 mL 100% 胎牛血清 （FBS） 加入 500 mL Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中。加入 5 mL 抗生素-抗真菌溶液 （100x）。
   2. 将所有试剂通过无菌的 500 mL 过滤瓶（0.22 μm 过滤器）。
3. 冻存细胞的解冻
   1. 在层流罩中，向 T75 培养瓶中加入 20 mL 生长培养基。在烧瓶上标上细胞名称、日期和传代号。在这项研究中，使用了贴壁的 C6 神经胶质瘤细胞。
   2. 在37°C....

讨论

我们提出了一种使用 2P-IVM 通过颅窗进行实时 体内 NP 跟踪的方法，以评估荧光标记的氧化铁 NP 的肿瘤递送。该手术的手术技术需要稳定的手和先进的实验手术技能。建议在继续体验活体动物之前练习使用尸体或幻影。作为替代方案，Hoeferlin等人实施了机器人钻头，以减少热损伤，最大限度地减少手术技术的可变性，并使手术标准化²²。

窗口的大小表?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride infusion solution	Baxter Corp	533-JB1301P
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092
1 mL syringes	BD	Luer-Lok syringe, REF309628
10% FBS	Thermo fisher	Cytiva SH30910.03HI
10% DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
2-photon microscope	Prairie Technologies, Bruker	Prairie Ultima IV
Alcohol applicators, 70%	Medline Industries, LP	MDS093810
Alcohol, spray bottle	Decon Labs Inc	Decon SaniHol, 04-355-122
Aluminum foil	Reynold Brands	Reynold Wrap non-stick aluminum foil
Anesthesia machine	Patterson Scientific	SAS3
Anesthesia monitoring	Kent Scientific	MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter
Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid	Invitrogen	15240-096
Betadine applicators	Professional Disposables International, Inc	S41125
Biopsy punch, 5 mm	Miltex	Size 5
Buprenorphine sustained release	Zoo Pharm	Bup SR Lab, 1.0 mg/mL	A generic drug can be used instead.
C6 rat glioma cell line	ATCC (American Tissue Culture Collection)	CCL-107
Cannulas	BD	16 G, 1.1/2”, 30 G, 1”
Carprofen	Pfizer	Rimadyl, 50 mg/ml	A generic drug can be used instead.
Cefazoline	Sagent Pharmaceuticals	25021-101-10, 1 g/vial	A generic drug can be used instead.
Cell strainer, 40 µm	Fisher Scientific	87711
Cotton tip applicators, 6”	Dyad Medical Sourcing, LLC	HCS1005
Dental cement	Stoelting Co	51459	Dental cement kit, clear, 2 components
Dexamethasone	Bimeda	138RX, 2 mg/mL	A generic drug can be used instead.
DietGel	ClearH2O	Recovery, 72-06-502
Drape	Cardinal Health	Bio Shield Wrap
Drill	Saeyang Microtech	Escort Pro, B08350
Drill tips	Hager & Meissinger GmbH	REF310104001001005	Size 005, US 1/4
FIJI imaging analysis software	National Institute of Health	https://imagej.net/software/fiji/
Forceps	Fisher Scientific	13-812-41
Gauze	Fisher HealthCare	Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469
Gelfoam	Ethicon Inc.	Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972
Germinator	Cellpoint Scientific	Germinator 500, No. 11688
Glass coverslips, 5 mm diameter	Fisher Scientific	Menzel Cover glass
Gloves, non-sterile	Fisher Scientific	Nitrile powder-free medical examination gloves
Gloves, sterile	Medline Industries, LP	MDS104070
Hair removal cream	Church & Dwight	Nair Hair remover lotion
Hamilton syringe	Hamilton Company Inc	Gastight #1701, 10 µL
HBSS without Ca, Mg	Fisher Scientific	PI88284
Head bar	Hongway	5 mm inner diameter O-rings
Heating pad	Stoelting Co.	Rodent warmer X2
Insulin syringes	Exel International Medical Products	29G x 1/2″
Iron oxide nanoparticles	Covis Pharma GmbH	Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501
Isoflurane	Dechra	26675-46-7
Mice	Jackson Laboratories	NSG, Strain 005557
Microscope (surgery)	Seiler Medical	Seiler IQ Q-100-220
Nanoparticles	Custom		Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate
Ophtalmic ointment	Major pharmaceuticals	Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964
Oxygen	Linde Gas & Equipment Inc.	High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540
Plastic cups	Georgia-Pacirif Consumer Products	Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400
Polyethylene tubing	Braintree Scientific	50-195-5494
Scale	Ohaus Corp	CR2200
Scalpel	Integra Life Sciences Production Corp	Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel
Scissors	Fisher Scientific	13-804-18
Sealant	Henkel Corp	Loctite 4014
Single use lab gown	High Tech Conversions	17-444-081
Stereotactic frame	Stoelting Co.	Stoelting New Standard TM
Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems	Fisher Scientific	S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE
Styrofoam box	N/A	N/A
Surgical gloves	Cardinal Health	19-163-108
Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive	3M Animal Care Prodcuts	1469SB
Tail vein cathether	Custom		Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing
TrypLE Express (1x), no phenol red	Invitrogen	12604-039
Ultraviolett torch	Spring sunshine technology	Consciot