使用类器官中的生物发光报告基因监测昼夜节律振荡

摘要

存在于大多数生物体中的昼夜节律调节着生物过程的时间组织。3D类器官最近作为一种生理学相关的 体外 模型出现。该协议描述了使用生物发光报告基因来观察类器官中的昼夜节律，从而能够对多细胞系统中的昼夜节律进行 体外 研究。

摘要

大多数生物体都具有昼夜节律，昼夜节律是在大约 24 小时内发生的生物过程，调节从睡眠-觉醒周期到新陈代谢的各种细胞和生理过程。这种时钟机制根据环境变化夹带生物体，并协调分子和生理事件的时间调节。以前，已经证明，即使在单细胞水平上，使用诸如NIH3T3成纤维细胞之类的细胞系也可以维持自主昼夜节律，这些细胞系有助于揭示昼夜节律的机制。然而，这些细胞系是均一培养物，缺乏多细胞性和强大的细胞间通讯。在过去的十年中，在3D类器官的开发、表征和应用方面进行了广泛的工作，3D类器官是 体外 多细胞系统，类似于 体内 形态结构和功能。本文描述了一种在人肠道肠道中使用生物发光报告基因检测昼夜节律的方案，该方案可以在 体外研究多细胞系统中的昼夜节律。

引言

生物钟
所有生物体，从细菌到哺乳动物，都与环境有着复杂而动态的关系。在这种关系中，适应环境变化对于生物体的生存至关重要。大多数生物体具有昼夜节律，使它们能够适应和优化其功能以适应大约 24 小时的昼夜周期。生物钟是由中央钟和外围钟组成的分层网络，它们协同工作以维持生理稳态并使生物体与日常变化保持同步 ^1,2。在哺乳动物中，位于视交叉上核 （SCN） 的中央或主时钟接收外部信号（例如光），并通过神经和体液信号通路的高级相互作用将信息传输到外周时钟³。除了中央时钟外，外周组织还拥有自己的细胞自主生物钟机制，由转录翻译负反馈回路 （TTFL） 维持，该机制调节组织特异性时钟控制基因 （CCG）^4,5。这种分子机制在细胞和生理事件中产生大约 24 小时的节律性，例如基因表达、信号通路、免疫反应和消化。昼夜节律时钟几乎存在于所有哺乳动物细胞中，并且已经证明高达 50% 的基因表达模式表现出昼夜节律性⁶。考虑到CCGs的丰富性，这种时钟机制的破坏可能会导致严重的生理问题。因此，有必要对昼夜节律进行研究，以阐明基本的生物学机制并开发新的治疗策略。

荧光素酶报告基因系统
在昼夜节律研究中，实时监测对于更好地了解细胞行为和反应至关重要，因为它可以跟踪基因表达和/或蛋白质水平的时间变化，从而深入了解由生物钟调节的分子机制。此外，实时监测使研究人员能够研究环境变化对分子机制的影响^7,8。有许多技术可用于实时监测研究，包括生物发光测定法，该测定法广泛用于跟踪基因表达或蛋白质水平随时间的变化。生物发光测定是一种使用光产生作为读数来检测生物过程的方法。在该测定中，产生生物发光的氧化酶（例如，荧光素酶）被瞬时或稳定地转染到感兴趣的细胞中，并且在底物（例如，荧光素）存在的情况下随着时间的推移测量生物发光读数。例如，荧光素酶通过在 ATP⁹ 存在下氧化底物荧光素来产生生物发光。由于其半衰期短，为3-4小时¹⁰，萤火虫荧光素酶是昼夜节律研究的强大工具，可以提供实时动态监测和最小的背景噪音11,12,13。对于带有荧光素酶标记的启动子或开放阅读框 （ORF） 的 DNA 插入，慢病毒基因递送系统是一种可靠的方法，可提供高转导效率、稳定整合和低免疫原性。生物发光报告基因的稳定转导在分裂细胞和非分裂细胞中提供稳健的表达，为昼夜节律研究提供一致的数据¹⁴。

类器官作为模型
传统的永生化二维细胞系在生物学研究中发挥了重要作用，从揭示昼夜节律的基本分子机制到药物筛选。尽管利用均质化细胞系很方便，但它们缺乏多细胞结构和细胞间相互作用。相比之下，类器官是体外 3D 多细胞“类器官”结构，通过显示与体内组织结构和多细胞性的相似性来模仿培养皿中的器官结构，包括干细胞、祖细胞和分化细胞类型^15,16。具有自组织、多细胞性和功能特性使类器官成为代表真实组织中发生的细胞和生理过程的显着体外模型¹⁷。不同类型的类器官可以通过定向分化从多能干细胞中获得，也可以从各种器官（包括小肠、大脑、肝脏、肺和肾脏）中获取成体干细胞^18,19。由于类器官结构具有真实的组织样结构和功能，具有多细胞性和动态细胞间相互作用，因此它们在理解体内组织中发生的细胞事件方面优于均质化细胞系。类器官也很容易操作，并且可以在受控条件下生长，这使得它们可用于昼夜节律研究²⁰。

这项工作的主要目的是介绍一种实时监测方法，利用专门为研究多细胞 3D 类器官中的昼夜节律而定制的生物发光测定法。使用生物发光测定技术实时监测细胞事件已被广泛用于缺乏真实组织中存在的多细胞复杂性和细胞间通讯的细胞培养物。3D类器官为在 体外研究多细胞系统中昼夜节律的功能提供了独特的机会。例如，人们可以研究具有改变的细胞组成或源自患者患病组织的类器官中的昼夜节律。该协议使得利用生物发光测定法来研究昼夜节律的不同方面，在更具生理相关性 的体外 模型，类器官中，这将有助于我们更好地了解昼夜节律在外周器官中的作用。

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研究方案

所有使用人体组织产生HIE的实验均已获得CCHMC的IRB批准（IRB#2014-0427）。有关与本协议中使用的所有材料有关的详细信息 ，请参阅材料表 。

注意：为了说明本协议中概述的程序，我们使用了 Bmal1-luc 人肠样蛋白 （HIE）。这些肠道样蛋白使用 pABpuro-BluF 报告质粒进行了稳定的慢病毒转导²² ，该质粒含有与荧光素酶融合的 Bmal1 启动子，显示了 Bmal1 启动子²¹ 的活性。

1. 慢病毒转导

1. 在干细胞富集的条件下进行慢病毒转导²² 以检测 HIEs。具体来说，确保在肠道生长培养基中传代后 3-4 天内在 HIE 中形成球状体，从而创造富含干细胞的条件。
2. 慢病毒转导²²后，用2μg/ mL嘌呤霉素进行抗生素筛选，回收嘌呤霉素耐药的HIEs，并以相对较高的密度（即1孔进入2孔）传代2-3x。如果HIEs的生长速度缓慢，则向肠道类器官生长培养基中加入10μM ROCK抑制剂（Y-27632）和10μM GSK-3抑制剂（CHIR-99021）。

2. 用于生物发光测定的类器官的制备

1. 第 1 天：将 HIE 传代到 35 毫米的圆形培养皿中。
   1. 简而言之，对于 HIE 的扩增，将 HIE 与生长因子降低 （GFR） 3D 培养基质混合，并将它们接种到 24 孔板上，每孔 3 滴 10 μL 3D 培养基质。加入 350 μL HIE 生长培养基，并每隔一天更换一次。
      注：3D培养基质中HIE的密度对于肠样蛋白的生长至关重要。大约，每个液滴中的球体数量应超过 50 个。如果这个数字很低，HIE的增长率就会受到负面影响。
   2. 当 HIE 充分生长（传代后约 7 天）时，从四个孔中收集 HIE 到 1.5 mL 微量离心管中。
   3. 使用台式小型离心机（2,000 × g）用冷 PBS 洗涤 HIE，快速旋转 40 秒，以通过移液管去除碎屑和过多的 3D 培养基质。
   4. 将 0.5 mL 冷 PBS 加入沉淀中，并通过使用 1 mL 胰岛素注射器注射多达 10 次来施加物理湍流以解离 HIE。
   5. 如步骤2.1.3所示，用台式小型离心机旋转解离的HIE，并通过移液管轻轻除去上清液。然后，将带有HIE沉淀的微量离心管放在冰上冷却约3分钟。
   6. 将 GFR 3D 培养基质添加到微量离心管中，并将其与 HIE 沉淀混合。
      注：根据将用于实验的 35 mm 圆形培养皿的数量计算 3D 培养基质的量。我们通常在每个圆形培养皿中接种 30 μL 3D 培养基质液滴。
   7. 将HIE和3D培养基质的混合物接种在35mm圆形培养皿的中心，并将培养皿在37°C下孵育20分钟以固化3D培养基质。
      注意：接种HIE的密度应通过实验确定。根据生物发光的强度，可以确定在此过程中HIE的数量。
   8. 向每个培养皿中加入 2 mL 预热的肠道类器官生长培养基，并在 CO₂ 培养箱中孵育培养培养皿直至下一步。
2. 第 3 天：开始分化
   1. 为了开始 HIE 的分化，去除生长培养基并加入 2 mL 预热的分化培养基。
      注：HIE分化培养基²³的配方见表1。
3. 第 4 天：无需其他过程。
4. 第 5 天：用 2 mL 预热的分化培养基替换肠样培养基。
5. 第 6 天：时钟同步和记录生物发光
   1. 为了同步肠道生物的分子钟，加入2μL的100μM地塞米松（Dex）以使每个培养皿中的终浓度为100nM，然后将培养皿在CO₂ 培养箱（37°C，5%CO₂）中孵育1小时²⁴。
   2. 在 Dex 重置期间，准备孵育光度计。检查孵育光度计的 CO₂ 和温度，并分别设置为 5% 和 37 °C。
      注意： 建议在每次使用机器之前和之后用 70% 酒精擦拭培养光度计的内部，以保持其无菌。
   3. 时钟同步后，用含有 200 μM D-荧光素的 3 mL 预热分化培养基补充肠样蛋白。
      注意：由于荧光素对光敏感，因此应将含荧光素的培养基用箔纸包裹并在37°C的热浴中预热，然后再将其应用于培养皿中。
   4. 将培养皿放入培养发光计的 8 孔培养皿台中，并用盖子盖住样品培养皿台。将两个装有湿纸巾或海绵的加湿器室放在样品台的顶部。这是一次性过程。
      注意：实验开始后，孵育光度计的盖子应保持关闭，直到实验终止。确保充分弄湿纸巾/海绵。
   5. 合上机器的盖子并启动程序以测量所需天数和分辨率的生物发光。
      1. 在软件上，通过单击“ 条件 ”选项卡选择条件设置，然后调整此面板上的设置：菜肴数量、测量时间、后台处理和过滤器类型。
         注意：在本演示中，我们选择了从 A 到 H 的所有培养皿; 默认测量时间，由软件根据培养皿的数量确定;后台处理的等待时间， 以及过滤器类型 F0。由于有三种滤光片选项，因此可以同时测量三种发光颜色。
      2. 根据实验输入所有合适的设置后，单击“ 确定”保存设置。
      3. 若要开始运行实验，请单击“ 运行 ”选项卡 | “开始 ”按钮（绿色三角形图标）。在运行实验时，通过在软件屏幕顶部进行适当的选择，将数据观察为原始数据、噪声过滤数据或去趋势数据。单击“ 原始”、“噪声过滤 ”或“ 去趋势 ”选项卡以观察所选数据。
      4. 观察信号长达 5 天。
         注意：在孵育光度计中监测 5 天后，肠道样蛋白可能会因培养基耗尽而开始死亡。为防止实验过程中任何可能的昼夜节律干扰，我们在实验期间不进行介质更换。
      5. 在实验结束时，单击“停止”按钮（蓝色方形图标）停止运行，转到“文件”选项卡，然后单击“另存为”。以 Kronos 格式保存数据;通过单击“文件”选项，然后在“文件”下选择“导出为 excel 格式”以进行进一步分析，在“文件”部分中将数据导出到电子表格中。

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结果

进行生物发光记录以评估人肠道类器官 （HIE） 在两种不同条件下的昼夜节律性：使用肠道类器官生长培养基（图 3）的干细胞富集条件与分化诱导条件，这是通过用分化培养基替换肠道类器官生长培养基来实现的。在实验当天，我们通过用100nM地塞米松进行1小时处理来同步生物钟。随后，我们用 3 mL 肠道类器官生长培养基或补充有 200 μM D-荧光素的分化培养基替换培养基，?...

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讨论

生物发光测定为昼夜节律的研究提供了几个优点，这需要从长期时间进程实验中收集数据。首先，它使研究人员能够在细胞移动和增殖时监测感兴趣的基因表达或蛋白质。在不进行不必要的调整或破坏细胞功能的情况下，可以使用生物发光读数来记录感兴趣的细胞事件或基因表达，从而提供可靠的实时数据。重要的是，与荧光测定相比，生物发光测定产生的背景噪声最小，因为它是在恒定的黑暗?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 x 10 Falcon tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772A
A 83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-028
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
BD Micro-Fine IV Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-829-1Bb	Mfrn: BD 329424
CHIR99021	Cayman Chemical	13122	GSK-3 inhibitor
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902-500MG
D-Luciferin (potassium salt)	Cayman Chemical	14681
Gastrin I Human	Sigma Aldrich	G9020
GlutaMAX	Gibco	35050061
Growth Factor reduced (GFR) Matrigel	Corning	CB-40230C
HEPES	Gibco	15630080
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	Stemcell Technologies	06010	Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium
Kronos Dio Luminometer Machine	ATTO Corporation	AB-2550
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma Aldrich	A9165
pABpuro-BluF reporter plasmid	Addgene	46824
PBS without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Recombinant murine EGF	PeproTech	315-09
Y-27632	R&D Systems	1254/10	ROCK inhibitor