MLH1 系列结肠癌患者外周血基因表达及其与结肠癌的关系

摘要

本研究检查了外周血中 MLH1 基因表达与结肠癌之间的关联，利用病例对照方法比较患者和匹配的健康对照者的表达水平。

摘要

MutL 同源物 1 （MLH1） 是异二聚体复合物 MutLα 的一个组分，可检测和修复由核苷酸错误掺入引起的碱基-碱基错配和插入/缺失环。在没有 MLH1 蛋白的情况下，未修复错配的频率增加，导致器官癌。目前的研究试图量化结直肠癌 （CRC） 患者血液样本中 MLH1 基因表达及其与肿瘤侵袭 （T） 和淋巴结浸润 （N） 的关系。从 36 例 CRC 患者获得血样。提取 RNA，并使用试剂盒合成 cDNA。使用外显子-外显子连接方法构建引物，并使用实时聚合酶链反应 （Real-Time PCR） 对 MLH1 和 β-肌动蛋白 基因进行 3 次检测。采用基因表达分析软件对数据进行分析，采用 t 检验检测 MLH1 的表达及其与 T 和 N 变量的联系。在本研究中，包括 36 名结直肠癌患者，包括 15 名 （41.6%） 女性和 21 名 （58.4%） 男性，平均年龄为 57.35 ± 4.22 岁，年龄在 26-87 岁之间。结果显示，与健康个体相比，患者 MLH1 基因表达比例降低，且疾病不同阶段基因表达降低显著。本研究结果表明， MLH1 基因表达的降低在 CRC 的发生中起着有效作用。

引言

结肠癌 （CRC） 是最常见的癌症类型之一。它是全球癌症相关死亡的第四大原因¹。男性的 CRC 比女性更常见，工业化国家的发病率是发展中国家的 3 到 4 倍。每 1 x 10⁵ 个 CRC 发病率的年龄标准化（全球）发病率为男女 19.7，男性 23.6，女性 16.3²。流行病学研究表明，环境和生活方式与 CRC 密切相关。肥胖、红肉/加工肉类、烟草、酒精、雄激素剥夺疗法和胆囊切除术都与 CRC 风险中度增加有关 ^2,3。

染色体不稳定性、微卫星不稳定性和 CpG 岛甲基化表型 （CIMP） 在 CRC⁴ 的肿瘤发生中起重要作用。根据以前的研究，已在 CRC 患者中鉴定出大约 250 种不同的突变，相当于大约 55% 的已知突变与 DNA 错配修复 （MMR） 基因有关。错配修复蛋白的缺陷可由 MSH6、MLH1、PMS2 和 MSH2 基因的种系突变引起，其中大多数突变存在于 MLH1 和 MSH2 基因中 ^4,5。MMR 系统中最重要的蛋白质是 MLH1，通常参与 CRC。最近的研究表明，MLH1 表达的任何变化都可能增加 CRC 的风险。MLH1 中的种系突变是导致 Lynch 综合征的原因，这是一种遗传性 CRC。此外，13%-15% 的弥漫性结肠癌病例是由基于体细胞启动子高甲基化的 MLH1 缺陷引起的 ^6,7,8。

MLH1 基因位于 3 号染色体短臂的 22.2 位，包含 21 个外显子⁹。由 MLH1 基因编码的蛋白质可以与参与错配修复的核酸内切酶 PMS2 合作产生 MutLα，这是 MMR 系统的一部分。MutLα 主要参与修复碱基-碱基错配以及由于 DNA 复制不完全而导致的缺失和加成环。此外，编码的蛋白质参与 DNA 损伤信号传导，并且可以与 MLH3 蛋白一起转化为 ɣMutL 形式，MLH3 蛋白参与减数分裂中观察到的 DNA 错配修复 10,11,12。研究表明，MLH1 参与其他主要细胞活动，包括细胞周期检查点的调节、细胞凋亡、交叉重组和有丝分裂不相容性¹³。

MLH1 基因在 DNA 错配修复 （MMR） 系统中起关键作用。该基因功能缺陷可导致基因突变的积累，从而导致结直肠癌的发展¹⁴。先前的研究表明，CRC 患者中约 55% 的 MMR 基因相关突变与 MLH1 基因突变有关。此外，MLH1 基因表达降低可导致 Lynch 综合征，这是一种遗传性结直肠癌^15,16。此外，在 13%-15% 的散发性结直肠癌病例中观察到基于体细胞启动子高甲基化的 MLH1 基因缺陷¹⁷。这些科学证据表明，MLH1 基因是结直肠癌的重要生物标志物，其表达分析可以提供有关 MMR 通路功能和 CRC 遗传风险的宝贵信息¹⁸。测量结肠癌患者外周血中 MLH1 的表达水平可以提供有关 MMR 通路功能的宝贵信息，而 MMR 通路在结肠癌中经常被破坏。该方法可用于预后目的并了解结肠癌的遗传易感性^19,20。一项关于中国患者 MLH1 415 位点 G 至 C 突变与散发性结直肠癌之间关系的研究发现，散发性 CRC 患者的 MLH1 C/C 基因型频率显著高于对照组，表明中国患者对散发性 CRC 的遗传易感性²¹。另一项研究比较了炎症性肠病 （IBD） 患者外周血和活检样本中 CRC 遗传生物标志物的基因表达，突出了外周血基因表达分析在了解结肠癌相关生物标志物方面的潜力²²。

考虑到 MLH1 基因的重要作用以及近几十年来通过分析 mRNA 表达进行分子分析的研究，癌症的分类精度更高。本研究的目的是使用实时 PCR 定量研究 CRC 患者外周血样本中 MLH1 的表达，并研究其与病理因素、肿瘤进展至肠壁层 （T） 阶段和浸润淋巴结阶段 （N） 的关系。这项研究是在 36 名 CRC 患者中进行的，以潜在地使用外周血样本确定基因表达的定量变化作为 CRC 筛查、预后和诊断的生物标志物。

研究方案

2021 年 4 月至 2023 年 5 月在南通大学附属 2 医院进行了一项病例对照研究。与医院的行政部门合作建立学习框架。通过向南通大学伦理委员会提交研究计划获得伦理批准。遵循伦理准则以确保机密性和知情同意。

1. 患者招募和研究设计

1. 纳入研究参与者的抽样
   1. 研究 MLH1 基因在 36 名结肠癌患者和对照组外周血中的表达。为参与者选择制定明确的纳入和排除标准。
   2. 招募被诊断患有特定类型结肠癌（直肠乙状结肠癌、盲肠癌、升结肠癌、横结肠癌和降结肠癌）并取得知情同意的个体。
   3. 排除患有其他癌症诊断或可能混淆基因表达分析的病症的个体。此外，排除最近 3 个月内有输血史、最近 6 个月内有化疗或放疗史、有酒精或药物使用史以及自身免疫性疾病或炎症性肠病病史的参与者。
2. 根据 TNM（肿瘤、淋巴结和转移）分期系统对临床危险因素进行分类，考虑癌症质量、肿瘤大小和对邻近器官的侵袭^23,24。
   1. 根据可用的病理文件数据划分不同的癌症分期 （0-4）。
   2. 将肠壁层（T指数）中的肿瘤生长和进展速率分割为四个不同的组（T1-4、T0-TX），将淋巴结浸润（N指数）分割为四个组（N1-3、N0-NX）。
3. 准备一个包含健康个体的对照组。
   1. 根据年龄和性别将对照组与患者组相匹配。收集每个参与者的详细人口统计数据，以确保可比性。
4. 知情同意程序
   1. 准备知情同意书，解释研究的目的、程序和潜在风险。
   2. 与参与者互动，为他们提供充足的时间来提问。在进行样本采集之前收集已签署的知情同意书。

2. RNA 的提取和纯化

1. 采集外周血样本
   1. 获得经认证可用于临床或实验室的市售 EDTA 涂层试管。验证试管的有效期。检查试管包装的完整性。
   2. 指导参与者舒适地坐着。使用无菌注射器，从肘前静脉抽取 5 mL 血液。确保参与者放松，手臂伸展以露出静脉。立即将血液样本转移到准备好的试管中，确保尽量减少与空气的接触。
   3. 在运输到实验室的过程中，将样品保持在 4 °C 以保持 RNA 完整性。
2. 按照制造商的说明使用 RNA 血液小型试剂盒进行 RNA 分离。
   1. 简而言之，通过将全血样品与 Buffer EL 在冰上孵育来裂解红细胞。离心以沉淀白细胞并弃去上清液。用 Buffer RLT 裂解白细胞，并使用 Shredder 柱匀浆裂解物。
   2. 将乙醇加入匀浆裂解物中，然后转移到离心柱中。用缓冲液 RW1 和缓冲液 RPE 洗涤色谱柱。通过向色谱柱中加入不含 RNase 的水并离心来洗脱纯化的 RNA。
3. 评估 RNA 数量和质量
   1. RNA 定量：使用分光光度计测量 RNA 浓度和纯度。在连接的计算机上打开软件。从主菜单中选择 Nucleic Acid 选项。将 1 μL RNA 样品涂在样品区域。
   2. 检测 RNA 的纯度和完整性
      注：使用 RNA 血液小量试剂盒纯化的总 RNA 的完整性和大小分布可通过分光光度计和凝胶电泳检查。核糖体 RNA 应显示为尖锐的条带或峰。28S rRNA 与 18S rRNA 的表观比值应约为 2：1。如果特定样品的核糖体条带或峰不清晰，但显示为较小尺寸 RNA 的拖尾;样品很可能在 RNA 纯化之前或期间发生了严重降解。
      1. 对于分光光度法测量，降低设备的臂并单击 Measure 以获得 A260/A280 比率。评估 RNA 样品纯度，目标是 A260/A280 比率在 1.8 和 2.0 之间。
      2. 如下所述进行 1% 琼脂糖凝胶电泳。
         1. 通过在 TAE 缓冲液中加热琼脂糖粉末直至溶解来制备 1% 琼脂糖溶液。向琼脂糖溶液中加入溴化乙锭，使终浓度达到 0.5 μg/mL。将琼脂糖-溴化乙锭溶液倒入凝胶灌注托盘中，使其凝固。
            注：溴化乙锭是一种荧光染料，可与 RNA 嵌入，以便在紫外光下进行可视化。
         2. 将 RNA 样品与上样染料混合，然后小心地将它们加载到固化凝胶的孔中。在 100 V 下运行凝胶电泳约 30 分钟，以按大小分离 RNA 片段。通过将凝胶放在紫外透射仪或成像系统上来观察 RNA 条带，这会导致溴化乙锭染色的 RNA 发出荧光。
4. 提取的 RNA 的储存
   1. 取提取的 RNA 样品。将 RNA 分装到无菌微量离心管中，每份使用 10 μL 体积。将 RNA 等分试样储存在 -80 °C 或更低温度下。
5. 将 RNA 逆转录成 cDNA
   1. 遵循逆转录试剂盒方案。在冰上和室温下解冻并制备必要的试剂。
   2. 进行基因组 DNA 去除反应以去除任何基因组 DNA 污染。
   3. 在冰上制备逆转录预混液，其中包含除模板 RNA 之外的所有组分。
   4. 将 DNA 去除步骤中的模板 RNA 添加到逆转录预混液中。将逆转录反应在 42 °C 下孵育 15 分钟。
   5. 通过在 95 °C 下孵育 3 分钟来灭活逆转录酶。使用等分试样的成品 cDNA 立即进行实时荧光定量 PCR，或将 cDNA 储存在 -20 °C 以备后用。

3. 用于实时荧光定量 PCR 的引物设计

1. 选择靶基因和内部对照
   1. 选择 MLH1 基因作为定量靶标，因为它与结肠癌相关。选择 β-actin 作为基因表达数据归一化的内部对照。
2. 引物设计过程
   1. 启动引物设计软件并输入从 Ensemble 或 UCSC 基因组浏览器获得的 MLH1 基因序列。
   2. 将引物的熔解温度 （Tm） 设置为 58-60 °C，最佳 GC 含量为 40%-60%，引物长度在 18-24 个核苷酸之间。
   3. 将设计的引物序列输入到 NCBI BLAST 数据库中以确认特异性。
      1. 转到 BLAST 网站，选择 Nucleotide BLAST。将引物序列粘贴到搜索框中，然后单击 BLAST。
      2. 分析结果以确保没有预测到脱靶扩增。有关详细信息，请参见 表 1 。

4. 实时 PCR

1. 实时荧光定量 PCR 反应体系构建。有关详细信息，请参见 表 2 。
   1. 将试剂在 4 °C 下以 10,000 x g 离心 5 分钟，以收集管底部的内容物。
   2. 根据商业试剂盒方案制备预混液，其中包括 SYBR Green、缓冲液、dNTP、MgCl₂ 和 Taq 聚合酶。
   3. 将预混液分配到标记的 PCR 管中，确保样品间体积的一致性。
   4. 将适当体积的 MLH1 和 β-肌动蛋白 的正向和反向引物添加到各自的试管中。
   5. 在逆转录前将 RNA 样品稀释至 100 ng/μL 的一致浓度，并使用逆转录试剂盒逆转录成 cDNA。
2. 扩增和数据收集
   1. 将 PCR 管放入实时荧光定量 PCR 系统中。
   2. 使用优化的循环条件对热循环仪进行编程：95 °C 20 秒用于变性，54 °C 30 秒用于退火，72 °C 30 秒用于延伸。具体请参见 表 3 。
   3. 将机器设置为运行 45 个周期。
   4. 在系统软件界面上实时监测反应，观察每个样品的扩增曲线。
   5. 包括不含 cDNA 的阴性对照，以检查污染。对每个样品重复 PCR 运行 3 次，以确保数据的可靠性。
3. 数据分析
   1. 完成循环后，使用系统软件分析阈值循环 （Ct） 值。将 Ct 值导出到电子表格程序中以供进一步分析。
   2. 使用 ^2-ΔΔCt 方法²⁵ 计算相对基因表达，将数据归一化为 β-肌动蛋白对照。

5. 免疫组化和遗传分析

1. 对组织切片进行免疫组织化学，以将 MLH1 蛋白表达与基因表达水平相关联。
   1. 准备组织载玻片并应用抗 MLH1 抗体。
   2. 使用 HRP 偶联的二抗和 DAB（3,3'-二氨基联苯胺）底物试剂盒。根据试剂盒说明开发载玻片，并用光学显微镜进行分析。
2. 进行甲基化特异性 PCR 和微卫星不稳定性检测，以区分 Lynch 综合征和散发性 CRC。
   1. 使用市售 DNA 提取试剂盒。遵循血液和肿瘤组织的试剂盒方案。
   2. 用亚硫酸氢盐转化试剂盒处理 DNA。使用专为 MLH1 启动子区域设计的甲基化特异性引物。根据试剂盒方案进行 PCR。
   3. 对 PCR 产物进行凝胶电泳，以观察甲基化状态。
   4. 对于微卫星不稳定性 （MSI） 测试，使用基因分析仪进行毛细管电泳。通过分析荧光标记的 PCR 产物来比较微卫星长度。

6. 统计分析

1. 使用商业统计分析软件进行数据分析。
   1. 打开软件并为基因表达和人口统计数据创建一个新数据集。
   2. 将相对基因表达值和相应的人口统计数据输入数据集。
   3. 使用 Kolmogorov-Smirnov 检验评估数据正态性。
      1. 从顶部菜单中选择 Analyze ，选择 Non-parametric tests，然后选择 Legacy Dialogs。
      2. 单击 Kolmogorov-Smirnov 检验 并输入基因表达的变量。执行测试并解释分布正态性显著性的输出。
   4. 进行 T 检验以比较患者组和对照组之间的 MLH1 基因表达。
      1. 选择 Analyze，然后选择 Compare Means，然后选择 Independent-Samples T Test。
      2. 将组成员身份 （患者或对照） 分配为分组变量，将基因表达分配为检验变量。运行测试并解释双尾显著性水平。
   5. 使用 ^2-ΔΔCt 方法计算基因表达的倍数变化²⁵.

结果

在这项研究中，检查了 36 例结肠癌患者外周血中 MLH1 基因的表达及其与结肠癌的关系。人口统计变量分析显示，女性 15 例 （41.6%） 患者，男性 21 例 （58.4%）。患者平均年龄 57.35 ± 4.22 岁，年龄范围为 26-87 岁。患者体重指数 （BMI） 状态显示，14 例患者 （38.8%） BMI 正常 （18.5 和 24.9 kg/m²），22 例患者 （61.2%） BMI 未在正常范围内 （低于 18.5 或高于 24.9 kg/m<...

讨论

本研究旨在研究 MLH1 基因的表达。在这项研究中，结果表明，与健康人相比，病人的 MLH1 基因表达水平降低。基于倍数变化研究，已经表明与健康人相比，病人 MLH1 基因在 II 期、III 期和 IV 期的表达显着降低。

由于其患病率和生存率，结直肠癌是世界癌症管理中的一个主要问题 ^3,27。考...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose Gel Electrophoresis Equipment	Bio-Rad	Mini-Sub Cell GT Systems	Used to check RNA quality
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E9884	Used as an anticoagulant for blood samples
NanoDrop	ThermoFisher Scientific	ND-2000	Spectrophotometer used to determine RNA purity
Real-time PCR Machine	Applied Biosystems	A34322	Used for RT-PCR reactions
RNA Extraction Kit	Intron Biotechnology Co	#Cat 17061	Used for RNA extraction from blood samples
SYBR Green PCR Kit	Thermo Fisher Scientific	4309155	Reagents used for RT-PCR experiments