激光诱导冲击波在爆炸性耳蜗损伤研究中的应用

摘要

在这里，我们描述了使用激光诱导冲击波 （LISW） 创建爆炸诱导耳蜗损伤动物模型的实验方案。颞骨暴露于 LISW 可以再现 MAG 诱导的耳蜗病理生理学。这种动物模型可以成为阐明耳蜗病理学和探索爆炸损伤潜在治疗方法的平台。

摘要

耳朵是最容易受到爆炸超压影响的器官，耳蜗损伤经常发生在爆炸暴露后。爆炸暴露会导致感音神经性听力损失 （SNHL），这是一种不可逆的听力损失，会对生活质量产生负面影响。先前已记录了详细的爆炸性耳蜗病变，例如毛细胞丢失、螺旋神经节神经元、耳蜗突触和立体纤毛破坏。然而，确定爆炸伤后耳蜗感觉神经性恶化具有挑战性，因为暴露于爆炸超压的动物通常会出现鼓膜穿孔 （TMP），这会导致并发传导性听力损失。为了评估纯感音神经性耳蜗功能障碍，我们使用激光诱导的冲击波开发了一种爆炸诱导的耳蜗损伤实验动物模型。这种方法避免了 TMP 和伴随的全身损伤，并在 LISW 暴露后以能量依赖性方式再现了 SNHL 成分的功能下降。这种动物模型可以成为阐明 MAB 诱导的耳蜗功能障碍的病理机制和探索潜在治疗方法的平台。

引言

听力损失和耳鸣是最普遍的残疾之一，据报道，高达 62% 的退伍军人患有听力损失和耳鸣¹。在暴露于爆炸超压的个体中，已经报道了几种爆炸诱发的听觉并发症，包括感音神经性听力损失 （SNHL） 和鼓膜穿孔 （TMP）²。此外，对暴露于爆炸中的个体的研究表明，即使听力阈值在正常范围内，爆炸暴露也经常导致听觉时间分辨率缺陷，这被称为“隐性听力损失 （HHL）”³。众所周知，在与原始细胞相关的耳蜗病理学中，内毛细胞 （IHC） 和听觉神经元 （AN） 之间的耳蜗突触大量丢失⁴。突触变性导致听觉处理受损，是 HHL⁵ 发展的主要因素。因此，听觉器官是包含复杂且高度组织结构的脆弱组成部分。然而，冲击波在细胞水平上影响内耳的确切机制仍不清楚。这是因为在实验室环境中复制爆炸损伤的精确临床和机械复杂性以及爆炸诱发的耳蜗病变的复杂性存在挑战。

爆炸伤的主要组成部分是冲击波 （SW），其特征是峰值压力快速而高地增加⁶。许多回顾性研究已广泛研究了爆炸伤的复杂性 ^7,8,9

研究方案

所有实验程序均已获得国防医学院机构动物护理和使用委员会 （批准 #18050） 的批准，并按照美国国立卫生研究院和日本文部科学省的指导方针进行。我们尽一切努力减少动物的数量及其痛苦。

1. 动物

1. 使用 8 周龄雄性 CBA/J 小鼠遵循此方案。实验前，对小鼠进行听力功能测试和鼓膜内窥镜观察，以确保正常。
2. 将 27 只 CBA/J 小鼠分为三组：（1） 2.0 J/cm² 暴露组（n = 9 只小鼠）;（2） 2.25 J/cm² 暴露组 （n = 9 只小鼠）;（3） 2.5 J/cm² 暴露组 （n = 9 只小鼠）。在 LISW 暴露 1 个月后取下所有耳朵进行评估。

2. LISW 曝光的实验设置

1. 激光靶是一个黑色的天然橡胶圆盘，直径为 10 毫米，厚度为 0.5 毫米。为了增加 LISW 脉冲，请使用丙烯酸树脂焊接胶粘剂将 1.0 mm 厚的透明聚对苯二甲酸乙二醇酯片材 （PET） 粘合到目标区域的顶部。照射 532 nm Q 开关 Nd：YAG 激光以在目标后面产生 LISW（图 1A

讨论

本研究旨在使用 LISW 验证爆炸诱导的耳蜗损伤小鼠模型。我们的研究结果表明，通过颞骨应用 LISW 后，暴露的小鼠耳朵在耳蜗中表现出一致的病理和生理下降，并伴有 LISW 超压的增加。这些结果表明，该小鼠模型适用于通过调整 LISW 输出来复制各种耳蜗病理。具体来说，这种 LISW 诱导的耳蜗功能障碍小鼠模型可以作为良好的耳蜗损伤模型，因为它具有可控、可重复和可量.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
532 nm Q-switched Nd:YAG laser	Quantel	Brilliant b
ABR peak analysis software	Mass Eye and Ear	N/A	EPL Cochlear Function Test Suite
Acrylic resin welding adhesive	Acrysunday Co., Ltd	N/A
confocal fluorescence microscopy	Leica	TCS SP8
cryosectioning compound	Sakura	Tissue-Tek O.C.T
CtBP2 antibody	BD Transduction	#612044
Dielectric multilayer mirrors	SIGMAKOKI CO.,LTD	TFMHP-50C08-532	M1-M3
Digital oscilloscope	Tektronix	DPO4104B
Earphone	CUI	CDMG15008-03A
Hydrophone	RP acoustics e.K.	FOPH2000
Image J software plug-in	NIH	measurement line	https://myfiles.meei.harvard.edu/xythoswfs/webui/_xy-e693768_1-t_wC4oKeBD
Light microscope	Keyence Corporation	BZ-X700
Myosin 7A antibody	Proteus Biosciences	#25–6790
Neurofilament antibody	Sigma	#AB5539
Plano-convex lens	SIGMAKOKI CO.,LTD	SLSQ-30-200PM
Prism software	GraphPad	N/A	ver.8.2.1
Scanning electron microscope	JEOL Ltd	JSM-6340F
Small digital endoscope	AVS Co. Ltd	AE-C1
Ultrasonic jelly	Hitachi Aloka Medical	N/A
Variable attenuator	Showa Optronics Co.	N/A	Currenly avaiable successor: KYOCERA SOC Corporation, RWH-532HP II
Water-soluble encapsulant	Dako	#S1964