小鼠远端眶下神经慢性缩窄损伤 （DIoN-CCI） 研究三叉神经性疼痛

摘要

小鼠远端眶下神经的慢性收缩损伤会引起自发行为（面部梳理活动增加）和伤害行为的变化，以响应触觉刺激（对 von Frey 头发刺激的高反应性），这是持续疼痛和异常性疼痛的迹象，并作为三叉神经性疼痛的模型。

摘要

动物模型仍然是研究神经性疼痛的必要工具。本手稿描述了远端眶下神经慢性缩窄损伤 （DIoN-CCI） 模型，用于研究小鼠的三叉神经性疼痛。这包括执行慢性缩窄性损伤的外科手术和术后行为测试，以评估自发和诱发行为的变化，这些变化是持续疼痛和机械性异常性疼痛的迹象。方法和行为读数类似于大鼠的眶下神经慢性收缩损伤 （IoN-CCI） 模型。然而，为了使 IoN-CCI 模型适应小鼠，需要进行重要的更改。首先，眼眶内入路被更喙入路所取代，在眼睛和胡须垫之间有一个切口。因此，IoN 在眶腔外的远端连接。其次，由于小鼠的运动活动较高，允许大鼠在小笼子中自由移动被将小鼠置于定制设计和制造的约束装置中所取代。DIoN 连接后，小鼠表现出自发行为的变化和对 von Frey 毛发刺激的反应变化，这与 IoN-CCI 大鼠相似，即增加定向面部梳理和对 IoN 区域的 von Frey 毛发刺激的高反应性。

引言

神经性疼痛是由于体感神经系统受损引起的，导致感觉信号异常地传递到大脑。躯体感觉神经损伤并不总是导致神经性疼痛，但患病率随着临床神经病变的严重程度而增加 ^1,2。神经性疼痛患者会出现特定症状，例如自发感觉（灼热感、针刺感、电感）和异常剧烈或长时间的疼痛，以及对无害或有害刺激的异常强烈或长时间的疼痛，这些刺激往往会变成慢性的，并且对常规止痛药物治疗有抵抗力³。神经性疼痛研究领域的重大进展源于发现大鼠坐骨神经周围的松散收缩结扎会导致类似于人类神经性疼痛状况的行为⁴。这些动物对热、冷和机械刺激的阈值降低，并表现出伤害性行为。尽管人类和啮齿动物之间的疼痛处理存在固有的生物学差异，但动物模型是研究神经性疼痛发展的潜在机制和测试新提出的治疗策略的宝贵工具。

基于感觉反射的疼痛测试范式已广泛用于神经性疼痛模型，但考虑到这些是影响生活质量的常见临床症状，测量持续疼痛或其他经常伴随的障碍（睡眠障碍、抑郁、焦虑）并未得到足够的重视 5,6,7,8 .大鼠的面部梳理行为已被证明是眶下神经 （IoN） 慢性收缩损伤 （CCI） 后自发性神经性疼痛的衡量标准^9,10。此外，大鼠还对 IoN 区域的轻度触觉刺激产生高反应性，这表明机械异常性疼痛。

与小鼠相比，由于大鼠的体型较大，它们更适合手术损伤。然而，小鼠具有成本和空间效率，并且需要的药物量较少。此外，转基因技术的出现进一步促进了小鼠的使用^11,12。因此，该程序的总体目标是在小鼠中进行手术眶下神经损伤，类似于大鼠，诱导自发和诱发行为的变化，以研究三叉神经性疼痛。

研究方案

根据国际疼痛研究协会 （International Association for the Study of PAIN） 的清醒动物疼痛研究指南，并符合佛兰德和欧洲动物研究法规以及 ARRIVE 指南，对动物进行治疗和照料。该协议由机构伦理委员会批准。

1. 动物

1. 使用雄性和雌性 C57BL/6J 小鼠 （Janvier，到达时 10 周龄）。
2. 将雄性和雌性小鼠分别饲养在湿度为 40%-60% 且室温 （RT） 为 21 ± 1 °C 的集落室中的标准实心底小鼠笼中。
3. 随意提供水和食物。
4. 将小鼠保持在正常的 12:12 小时暗/亮周期（08:00 开灯）。

2. 手术

1. 每只小鼠准备一块约 6 厘米长的铬肠结扎线 （6-0），并将其置于无菌盐水中，以避免干燥和变硬变脆。
2. 用氯胺酮/甲苯噻嗪（75/15 mg/kg，腹膜内，注射体积 10 mL/kg）麻醉小鼠。通过捏住脚趾之间的皮肤来检查麻醉深度。确保鼠标不会弯曲其腿。如有必要，等到动物完全麻醉和/或给予额外的氯胺酮/甲苯噻嗪。
   注意:不应给予补充镇痛药，以避免可能干扰三叉神经性疼痛发展的先发制人镇痛作用。
3. 轻轻剃掉胡须垫和眼睛之间的颊毛，在眶下孔的喙部做一个大约 4 毫米的切口。注意不要损坏胡须，因为这可能会影响行为测试。
4. 将鼠标的头部固定在立体定位框架中，或以其他方式固定头部。将鼠标放在加热垫上，否则要注意保持体温。
5. 在双眼涂抹软膏以避免干燥。用酒精擦洗剃光的头部区域，然后用优碘擦洗。放置手术单，露出剃光的头部区域。
6. 使用显微镜进行步骤 2.7 至 2.14。
7. 在胡须垫边缘和眼睛之间大约一半处垂直于中线做一个 4 毫米的皮肤切口，刚好位于眶下孔的嘴部，并以眼睛中心和胡须垫中心之间的线为中心。
8. 通过钝分离浅表结缔组织来暴露 IoN。注意尽量减少肌肉组织损伤并避开运动神经纤维。确保 IoN 的躯干（直径 1-1.5 毫米）在它离开颅骨的位置和分支到晶须垫的位置之间大约有 3 毫米深（图 1）。
9. 使用旋转动作，将钩状结扎辅助装置的头部滑到 IoN 下方，注意不要损伤神经。
10. 将铬肠结扎线穿过结扎辅助装置尖端的孔并缩回结扎辅助装置，使结扎线保持在 IoN 下方，并且结扎线的两端与 IoN 的距离或多或少相等。
11. 从结扎线的两端打一个"滑结"，然后将结滑到 IoN 上。确保滑结允许平稳的动作，以便准确控制收缩程度。进一步滑动结并收缩 IoN。将神经的直径减少一个明显的量⁴.在狭缝结的顶部打一个普通结，以防止其滑落。
12. 剪断结扎线的末端，留下大约 1.5 毫米的自由端，以防止打结解开。
13. 按照步骤 2.2-2.8 进行假手术。
14. 使用合成可吸收缝合线 （6-0） 闭合皮肤切口，让动物在加热垫上或红外加热灯下恢复。

3. 行为测试

1. 在术前测试前至少 8 天让鼠标适应外壳条件。
2. 在术前测试之前，让小鼠每天至少适应一次测试程序，持续 3 天。
3. 在正常照明条件下进行测试。如有必要，提供背景噪声以最大程度地减少外部噪声的干扰。
4. 观察面部修饰行为
   1. 将一只鼠标从外壳带到测试室，放在一个带盖的塑料笼中，没有任何床上用品。运输动物时避免外部刺激。
   2. 将鼠标放在摄像机前没有床上用品的有盖透明塑料笼中（长 x 宽 x 高:12 厘米 x 12 厘米 x 17 厘米）。放置一面镜子，以便在动物背对相机时查看动物的面部。
   3. 记录鼠标的行为 10 分钟。在记录过程中，确保实验者不在房间内。
   4. 记录下一只动物后，清洁观察笼。
   5. 让对鼠标实验条件不知情的观察者分析记录的行为。
   6. 在分析 10 分钟的录音时，记下每个面部修饰情节。面部美容是动物将前爪与面部区域接触的运动模式。
   7. 区分孤立的面部修饰和身体修饰期间的面部修饰行为⁹.如果某个序列之前或之后没有身体修饰，则该事件将被标记为孤立的面部修饰。身体美容被定义为使爪子、舌头或门牙与面部或前爪以外的身体区域接触的运动模式。如果在面部修饰序列之前或之后存在身体修饰，则该事件将在身体修饰期间标记为面部修饰。
   8. 通过应用 4 秒截止标准来确定面部修饰次数。梳理动作之间小于 4 秒的时间段定义为单个剧集中的暂停。大于 4 秒的时间段定义为两次发作之间梳理操作的完全中断。
5. 机械刺激测试
   1. 将小鼠分成最多 6 只动物一组，放在带床上用品的有盖笼子里带到测试室。同样，要注意避免外部刺激。
   2. 将老鼠一次一只地放在桌子上。
      1. 将鼠标尾部放入柔软的硅胶夹中，并通过磁性将夹子连接到桌子上的金属板上。硅胶材料可防止尾部从夹子上滑落，同时最大限度地减少对尾部的压力。
      2. 将三壁塑料支架 （65 mm x 25 mm x 23 mm） 放在动物身上，这样只有鼠标的头部从容器中伸出。支架的尺寸允许头部和前爪移动，但会阻止动物在其内部转身。最后，在支架顶部放置一个重物以将支架固定到位（图 2）。
   3. 使用四根 von Frey 头发的分级系列。弯曲毛发所需的力为 0.02 g、0.16 g、0.4 g 和 1.0 g。
   4. 让小鼠习惯于限制器和伸展运动 10 分钟。每 30 秒，每只动物进行一次伸手动作。
   5. 当动物处于放松状态时，在弧形中心附近的 IoN 区域内慢慢涂抹最浅的 von Frey 毛发，直到 von Frey 毛发弯曲。确保刺激时间不超过 1 秒。
   6. 对动物对刺激的反应进行评分，以适合以下反应类别之一。
      1. 如果没有响应，则给出 0 分。
      2. 给检测打分 1 分，即鼠标将头转向刺激对象，然后探索刺激对象。
      3. 给戒断反应打 2 分，即在施加刺激时，鼠标轻轻地将头转开或快速向后拉;有时，在受刺激区域同侧会出现单面擦拭。
      4. 攻击得分为 3，即鼠标攻击刺激对象，做出咬人和/或抓取的动作。
      5. 给不对称面部修饰打 4 分，即鼠标表现出一系列不间断的至少三次洗脸笔触，直接针对受刺激的面部区域。
   7. 对于每只小鼠，按强度升序涂抹 von Frey 毛发，并随机刺激同侧和对侧。在每侧应用每种刺激强度一次。
   8. 根据对每只动物体内四根 von Frey 毛发的响应计算平均分数。计算同侧和对侧的单独分数。

结果

DIoN-CCI 小鼠在术后孤立面部修饰所花费的时间和孤立面部修饰发作次数的显著增加（图 3）。最强的增加发生在术后第一周，然后在接下来的几周内变得更小，但至少在 6 周内显著增加。身体美容期间的面部美容或多或少不受影响。

在 DioN-CCI 后的第一周内，DIoN-CCI 小鼠对同侧 IoN 区域的同侧机械刺激几乎完全没有反应（

讨论

在大鼠中，先前已经争论认为，考虑到完整的精细肌肉组织控制震颤触觉辨别中复杂搅拌模式的重要性以及中线切口到皮肤眶下神经区域的相对距离^10，IoN 的眶内入路是可取的。其他人则认为，通过切口进入振震垫尾部的毛状皮肤的远端入路有很多好处^13,14。从手术上讲，这是一种更简单的微创技术。它可以?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromic catgut (6-0)	Dynek	CG602D	ligatures
Cotton applicator	Pharmacy
Digital video camera	Sony	HDR-CX330E
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-10
Dumont forceps - Micro-blunted tips (#5/45)	Fine Science Tools	11253-25
Duratears	Alcon	0037-820	ophthalmic ointment
Hooked ligation aid	Fine Science Tools	18062-12
Ketalar	Pfizer		ketamine (50 mg/mL)
Operation microscope	Kaps	SOM 62
Precision cotton swab	Qosina	10225
Precision trimmer	Philips	HP6392/00
Rompun	Bayer		xylazine (2%)
Scissors - blunt tips	Fine Science Tools	14574-09
Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer kit	Stoelting	58011
Vicryl Rapide	Ethicon	MPVR489H	sutures