射血分数保留的高脂血症诱导心力衰竭小鼠模型

摘要

该协议提出了一种详细的方法，用于复制高脂血症诱导的射血分数保留（HFpEF）的小鼠模型。该设计结合了腺相关病毒 9-心肌肌钙蛋白 T 低密度脂蛋白受体 （AAV9-cTnT-LDLR） 和泊洛沙姆-407 （P-407） 的给药。

摘要

由脂毒性驱动的射血分数保留型心力衰竭 （HFpEF） 的病理生理学尚不清楚。鉴于迫切需要准确模拟心脏代谢 HFpEF 的动物模型，通过对 HFpEF 患者中看到的表型进行逆向工程，开发了一种高脂血症诱导的小鼠模型。该模型旨在研究 HFpEF，重点关注脂毒性与代谢综合征之间的相互作用。通过每两周腹膜内注射泊洛沙姆-407 （P-407），一种阻断脂蛋白脂肪酶的嵌段共聚物，结合单次静脉注射腺相关病毒 9-心肌肌钙蛋白 T-低密度脂蛋白受体 （AAV9-cTnT-LDLR），在 129J 菌株背景的野生型 （WT） 小鼠中诱导高脂血症。在治疗后 4 至 8 周之间进行了广泛的评估，包括超声心动图、血压记录、全身体积描记法、超声心动图 （ECG） 遥测、活动轮监测 （AWM） 以及生化和组织学分析。LDLR/P-407小鼠在4周时表现出明显的特征，包括舒张功能障碍、射血分数保留和左心室壁厚度增加。值得注意的是，血压和肾功能保持在正常范围内。此外，ECG 和 AWM 分别显示心脏阻滞和活动减少。舒张功能在八周时恶化，伴有呼吸频率显着下降。对双重治疗模型的进一步研究揭示了纤维化、湿/干肺比值和心脏重量/体重比值升高。LDLR/P-407小鼠表现出黄瘤、腹水和心肌缺血。有趣的是，猝死发生在治疗后 6 到 12 周之间。小鼠 HFpEF 模型为阐明在脂毒性介导的 HFpEF 背景下导致舒张功能障碍的代谢综合征的复杂性提供了一种有价值且有前途的实验资源。

引言

射血分数保留型心力衰竭 （HFpEF） 是指伴有多种合并症的心脏代谢综合征，占所有心力衰竭病例的 50% 以上 ^1,2。此外，HFpEF 的频率在过去十年中稳步上升³.由于治疗选择有限，鉴于其多方面的病理生理学，HFpEF 代表了心血管疾病中最重要的未满足的医疗需求⁴。因此，迫切需要加强对 HFpEF 潜在机制和病理生理学的理解，以开发有效的治疗方法。

尽管近年来取得了重大进展，但归因于脂毒性的 HFpEF 的病理生理学仍然不完全清楚。已经确定，与射血分数降低的心力衰竭 （HFrEF） 和对照健康对照者相比，HFpEF 患者表现出显着的心肌脂质积累⁵。心脏活检的 RNA 测序数据显示，与健康和 HFrEF 患者相比，HFpEF 组的脂蛋白脂肪酶 （LPL） 基因下调⁶。Poloxamer-407 （P-407） 是一种嵌段共聚物，通过阻断 LPL 并随后增加血浆甘油三酯和低密度脂蛋白 （LDL） 胆固醇来诱导高脂血症⁷。先前的研究表明，HFpEF 小鼠心脏中的 LDL 受体 （LDLR） 表达很高⁸。

基于这些发现，并认识到迫切需要准确模拟心脏代谢HFpEF的动物模型，开发并提出了高脂血症诱导的小鼠模型。该模型是为探索 HFpEF 而量身定制的，明确关注脂毒性与代谢综合征的参与。在高脂血症/LPL阻断和增强心脏LDLR表达的诱导下，通过每两周腹膜内（ip）注射P-407结合单次静脉注射腺相关病毒9-心肌肌钙蛋白T-LDLR（AAV9-cTnT-LDLR）⁹，在129J背景的WT-129小鼠中建立了该模型。

在治疗后 4 至 8 周之间，进行了一系列广泛的评估，包括超声心动图、血压记录、全身体积描记法 （WBP）、连续心电图 （ECG） 遥测、活动轮监测 （AWM） 以及生化和组织学分析⁹。在四周时，LDLR/P407 或“双重治疗”小鼠表现出明显的 HFpEF 特征，包括舒张功能障碍、射血分数保留和左心室壁厚度增加⁹。此外，心电图遥测和 AWM 分别显示心脏阻滞和活动减少。值得注意的是，血压和肾功能保持正常⁹.到八周时，舒张功能恶化，WBP 测量结果显示呼吸频率降低⁹。

对双重治疗模型的进一步探索揭示了纤维化、湿/干肺比值升高和心脏重量/体重比值⁹。尸检发现腹水、心肌缺血和黄瘤。有趣的是，在治疗后 6 到 12 周之间记录了猝死⁹。这种小鼠高脂血症驱动的 HFpEF 模型提供了一种快速、有价值且有前途的实验工具，用于揭示代谢综合征的复杂性，这些综合征会导致脂毒性介导的 HFpEF 舒张功能障碍。

研究方案

该动物方案由迈阿密大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准，符合美国国立卫生研究院 （NIH） 指南（IACUC 协议 23-103-ad03）。在本研究中，129J 背景的野生型 （WT） 小鼠是从商业来源（见 材料表）获得并在内部繁殖的。所有小鼠均为129J背景上的同窝小鼠。实验包括雄性和雌性小鼠。LDLR/P-407 HFpEF 小鼠通过在第 1 周给药单剂量 AAV9-cTnT-LDLR 和每两周给药 p407 四周来建立。

1. AAV9-cTnT-LDLR的制备和给药

注：AAV9-cTNT-hLDLR质粒（参见 材料表）编码完整的人LDLR蛋白（2664bp）（图1）。

1. AAV-LDLR病毒载体制备
   1. 根据动物的数量，将AAV9储备瓶在冰上解冻20分钟，然后在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中稀释AAV颗粒，以获得100μL中1×^{10 12} 个载体基因组/小鼠的浓度。
   2. 将病毒溶液放入 1 mL 注射器上的 28-30 G 针头中。注意避免将气泡吸入针头。
2. 静脉注射 （i.v.） 尾静脉注射程序
   1. 将氧气打开至 0.5 L/min，并将异氟烷麻醉系统设置为 4%-5%。将小鼠置于诱导室中~2分钟，直到动物没有反应。
   2. 将动物放在小鼠尾巴照明器限制器上（例如，Braintree Scientific，Inc.（马萨诸塞州布伦特里）），并将动物放在侧卧。使用异氟烷麻醉至2%-3%进行维持。
      注意：限制装置的加热将导致小鼠尾静脉扩张，因此更容易注射。
   3. 识别侧尾静脉。使用纱布垫用防腐剂清洁注射区域。
   4. 握住尾巴的末端以伸展它，然后用手指按摩鼠标尾巴，直到可以看到静脉。以低角度（10-15度角）插入针头，并将100μL稀释的AAV注射到尾静脉中（图2A）。
   5. 拔出针头并立即用手指施加压力，直到出血停止。将鼠标放回原来的笼子里。

2. P-407的准备和管理

1. P-407 准备
   1. 通过在通风橱内用 DPBS 将 P-407 试剂（参见 材料表）稀释至终浓度为 100 mg/mL 来制备溶液。将溶液在4°C下在旋转器上冷藏过夜，以促进P-407¹⁰的溶解。
2. 每两周一次腹膜内 （ip） 注射程序
   1. 在腹腔内注射的第一天称重每只小鼠。使用公式1g / kg，根据重量和预填充注射器计算每只小鼠的适当剂量。
   2. 在通风橱下，手动约束鼠标，头部和身体向下倾斜，以便在颅骨上重新定位内部器官。这种技术避免了刺穿附近的重要结构。
   3. 识别腹部下象限的左腹膜腔，位于中线外侧。用消毒剂清洁现场。
   4. 以 45 度角或更小的角度将针头插入腹膜腔（图 2B）。吸出注射器以确保充分插入。
   5. 如果抽吸时有血液或组织，请拔出针头并重复步骤 2.2.2 -2.2.4，直到注射器透明。将针头丢弃在适当的锐器容器中，然后将鼠标放回原来的笼子中。

3.超声心动图评估

1. 制备
   1. 在成像前一天或前几个小时将脱毛膏涂抹在小鼠的胸部和上腹部。2分钟后用湿纱布去除奶油。
   2. 用2.5%-3.0%异氟烷以0.8L / min的流速麻醉小鼠，并用1%-1.5%异氟烷维持。然后，将鼠标以仰卧姿势固定在适当的平台上，爪子放在装有导电凝胶的电极垫上，并用鼻锥覆盖鼻子和嘴巴，以确保用异氟醚持续麻醉。
2. 胸骨旁长轴视图
   1. 将鼠标置于仰卧位，将平台的右侧倾斜 45 度。
   2. 接下来，将传感器探头对准轨道系统中，从右上肢到左腹以顺时针方向倾斜 30-40 度，以获得并存储 B 模式图像。
   3. 使用超声分析软件（参见 材料表）分析B模式图像以获得射血分数（图3A）。
3. 胸骨旁短轴视图
   1. 将导轨系统中的传感器探头顺时针旋转 90 度，以获取并存储 B 模式和 M 模式图像。
4. 顶端视图
   1. 将平台的左上角向下并向右倾斜。将换能器朝向动物的右肩。
   2. 在 B 模式和彩色多普勒模式下可视化二尖瓣。采集和存储脉冲波 （PW） 多普勒和组织多普勒图像⁵.
   3. 使用超声分析软件分析PW多普勒和组织多普勒图像，以获得IVRT，E / E'和E / A（图3B-E）。

4. 压力-容积（PV）回路数据记录

1. 在研究结束时进行血流动力学分析，以评估左心室 （LV） 收缩压和舒张功能，遵循先前描述的程序^11,12。
   1. 首先用异氟烷（3-5%，诱导室）诱导小鼠。
   2. 当麻醉作用开始时，将动物转移到手术台上，并用异氟烷（1-3%，面罩）保持麻醉。
   3. 在颈部上方的皮肤上做一个小切口，以便进行气管插管（通过口腔）。
   4. 使用设置为~0.15-0.2mL体积和120-170呼吸/分钟的呼吸频率的啮齿动物呼吸机（例如，Micro vent model 848，Harvard Apparatus）用氧气和异氟醚的混合物给动物通风。
   5. 在整个手术过程中，使用温控手术台监测 ~37 °C ± 1 °C 的体温。
   6. 用 30 G 针头暴露并插管左颈内静脉，用于液体支持给药。
   7. 切开正中腹颈部位的皮肤，露出颈动脉。右颈动脉远端部分闭塞后，在动脉上做一个小切口，以便将微尖端压力容积 （PV） 导管（见 材料表）引入左心室（闭合胸部入路）。
   8. 记录稳态和下腔静脉闭塞期间的 PV 循环。
   9. 在实验结束时，使用经批准的 AVMA 方法（例如，异氟烷，然后颈椎脱位）对动物进行人道安乐死（在深度麻醉下）。
   10. 使用 LabChart 软件（参见 材料表）分析 PV 数据，并使用超声心动图测量校准体积。

讨论

尽管 HFpEF 的患病率在过去十年中稳步上升，但对潜在病理生理学的具体理解仍然难以捉摸¹³.此外，截至目前，存在有限的循证疗法¹³.提高对心脏代谢 HFpEF 所涉及的机制的理解是必要的。此前，引入了一种高脂血症小鼠模型，该模型模拟 HFpEF，既不是慢性肾脏病 （CKD），也不是心脏 LDLR OE 和 p407 注射诱导的高血压⁹。

研究结果显示，心脏 LDLR OE 和高脂血症的组合在 4 周后导致小鼠舒张功能障碍、心律失常、左心室 （LV） 肥大、运动不耐受、心脂积累和纤维化，如前所述⁹。还观察到这些小鼠的心脏、肝脏和骨骼肌中低密度脂蛋白胆固醇摄取增加，心脏和肝脏中甘油三酯降低⁹。该方法的优点在于其研究心脏代谢综合征途径的快速性，与其他高脂血症HFpEF小鼠模型相比，这些途径尚未得到很好的理解，例如高脂饮食（HFD）需要长达16周和20周才能发育¹⁴。该模型需要四周时间开发，并模仿人类的代谢异常。因此，该模型的可重复性至关重要。

当务之急是确保AAV9-cTnT-LDLR和P-407的彻底准备和管理。该模型的可复制性高度依赖于 P-407 和 AAV9-cTnT-LDLR 浓度和剂量的准确计算，以及重量测量。同样重要的是溶液制备和适当的静脉内和腹膜内注射技术。这些技术的偏差可能会导致重大的改变和不希望的结果。

尽管这种模型具有有效性和效率，但仍存在一些局限性。进行静脉注射和腹膜内注射需要严格的培训。此外，静脉注射和频繁腹膜内注射存在潜在的发病和死亡风险。进行静脉注射时可能会导致小鼠尾部损伤，而腹膜内注射时可能会发生盲肠穿刺，从而导致腹膜炎¹⁵。这些伤害通常是由于不正确的技术造成的，并可能导致实验对象和治疗的损失。因此，在执行这些程序之前，有必要进行广泛的培训。另一个限制是该模型将重点放在 129J 菌株上。选择 129J 菌株的基本原理源于初步研究，与我们最初在未发表的研究中研究的 C57BL/6 小鼠相比，该菌株的舒张功能障碍和 HFpEF 发现更快。

无论这些局限性如何，该模型将允许更快速地研究HFpEF涉及的潜在机制和潜在的有效治疗方案。先前的研究已经导致心脏代谢 HFpEF 诱导的 HFD 和 N[w]-硝基-l-精氨酸甲酯 （L-NAME） 在 5-15 周内的病理生理学模型的发展¹³.然而，由于 HFpEF 患病率的稳步上升，迫切需要进一步了解心脏代谢性 HFpEF 的病理生理学并开发有效的治疗方法。这种心脏 LDLR OE 和 p407 诱导的高脂血症的小鼠模型是一种快速可行的诱导心脏代谢 HFpEF 的方法，用于未来的研究工作。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adeno-associated virus 9-cardiac troponin T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR)	U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP)		Transgene plasmids and AAVs particles were generated by the U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP). AAV were provided in Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) with 0.001% Pluronic F68. The Core determined AAV titers by digital droplet polymerase chain reaction (ddPCR) and assessed all preparations for capsid protein ratio by SDS-PAGE and for the presence of endotoxin. Constructs include the human (h) transcripts tagged by 3X HA, Penn Vector Core (RRID: SCR_022432). AAV9-cTNT-hLDLR plasmid encodes the full human LDLR protein (2664bp).
Imaging systems with a high frequency transducer probe MS400	(VisualSonics, Toronto, ON, Canada)	Vevo 2100 or 3100
Isoflurane	Akorn Animal Health, Inc.	NDC: 59399-106-01
LabChart  software	ADInstruments	Pro version 8.1.5
Poloxamer 407	Sigma-Aldrich	16758
PV catheter	Millar Instrument	PVR 1035
Ultrasound analysis software	Vevo Lab
Wild-type (WT) mice on 129J background	Jackson Laboratory