悬浮培养物生产和纯化腺相关病毒的碘克沙醇密度梯度离心用于体内应用

摘要

腺相关病毒在悬浮细胞培养物中产生，并通过双碘克沙醇密度梯度离心纯化。包括提高总病毒产量、降低病毒沉淀风险和进一步浓缩最终病毒产物的步骤。预期最终滴度达到 10¹² 个病毒颗粒/mL，适用于临床前 体内 使用。

摘要

该协议描述了通过碘克沙醇密度梯度离心产生和纯化的重组腺相关病毒（rAAV），这是一种与血清型无关的纯化AAV的方法，于1999年首次描述。rAAV载体广泛用于基因治疗应用，将转基因递送至各种人类细胞类型。在这项工作中，重组病毒是通过用编码转基因、载体衣壳和腺病毒辅助基因的质粒在悬浮培养物中转染 Expi293 细胞来生产的。碘克沙醇密度梯度离心法根据颗粒密度纯化完整的AAV颗粒。此外，这种现在无处不在的方法还包括三个步骤，以提高病毒总产量，降低由于污染蛋白质而沉淀的风险，并进一步浓缩最终病毒产物，分别：使用聚乙二醇（PEG）和氯化钠溶液从细胞培养基中沉淀病毒颗粒，引入第二轮碘克沙醇密度梯度离心， 以及通过离心过滤器进行缓冲液置换。使用这种方法，可以在体内使用时始终如一地达到 10¹² 个病毒颗粒/mL 的异常纯度。

引言

重组腺相关病毒 （rAAV） 载体是治疗遗传性疾病（包括脊髓性肌萎缩症、视网膜营养不良症和 A 型血友病）的广泛使用工具 ^1,2,3。rAAV 载体经过工程设计，缺乏野生型 AAV 4 中存在的病毒基因，野生型 AAV⁴ 是一种具有线性单链 4.7 kb DNA 基因组的小型非包膜二十面体病毒。AAV 于 1960 年代首次被发现是腺病毒制剂的污染物⁵。尽管其衣壳尺寸小，将可包装的转基因的大小限制为最大 4.9 kb（不包括^{ITRs 6}），但 AAV 可用于转基因递送，因为它在人类中无致病性，允许在许多分裂和非分裂细胞类型中表达转基因，并且免疫原性作用有限⁷。

作为依赖细小病毒属的成员，rAAV 的产生依赖于腺病毒或单纯疱疹病毒⁸ 中存在的辅助基因的表达。已经开发了几种产生 rAAV 的策略，但在用腺病毒 E1A/E1B 辅助基因转化的 HEK293 细胞中生产是当今使用的最成熟的方法⁹。rAAV 生产的一般....

研究方案

表1提供了该协议中使用的溶液和缓冲液的组成。

溶液	组成
AAV裂解缓冲液	1.2 mL 5 M NaCl 溶液
	2 mL 1 M Tris-HCl pH 8.5 溶液
	80 uL 1 M MgCl2 溶液
	mQ 水至 40 mL
AAV沉淀液	40克PEG 8000
	50 mL 5 M NaCl 溶液
	mQ 水至 100 mL
15%碘克沙醇馏分

讨论

双碘克沙醇密度梯度纯化方案是通用方法，因为它适用于任何AAV突变体变体，无论其受体特异性如何。早期的AAV纯化方法依赖于颗粒密度，包括CsCl中的等脁离心和连续蔗糖密度梯度离心¹⁹。后来，开发了血清型特异性方法，该方法利用与琼脂糖柱²⁰ 结合的单克隆抗体。1999 年开发了一种使用不连续碘克沙醇梯度的基于密度的新型纯化方法，并产生了比从 CsCl 梯?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5810 R benchtop centrifuge	Eppendorf	22625501
8-channel peristaltic pump	Watson-Marlow	020.3708.00A
Automated cell counter	NanoEntek	EVE-MC
Avanti J-E high-speed centrifuge	Beckman Coulter	369001
Benzonase	Thermo Scientific	88701
Biological safety cabinet	Labconco	322491101
CO2 incubator with shaker			Set at 8% CO2 and 37 °C
Conical centrifuge tubes	Thermo Scientific	339652	50 mL
Conical centrifuge tubes	Thermo Scientific	339650	15 mL
Disposable micro-pipets	Fisherbrand	21-164-2G	Capillaries
Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2  (DPBS) (10x)	Sigma-Aldrich	D1408
ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope	Nikon
Expi293 Expression Medium	Gibco	A1435101
Expi293F cells	Gibco	A14527
Filter tips	USA Scientific	1126-7810	1000 µL
Filter tips	USA Scientific	1120-8810	200 µL
Filter tips	USA Scientific	1120-1810	20 µL
Filter tips	USA Scientific	1121-3810	10 µL
Hypodermic needles	Tyco Healthcare	820112	20 GA x 1-1/2 A
Ice bucket with lid	VWR	10146-184
JS-5.3 rotor	Beckman Coulter	368690
Magnesium chloride solution (1 M)	Millipore Sigma	M1028-100ML
Metal stand and clamp	Fisherbrand	05-769-6Q
Microcentrifuge tubes	Eppendorf	22600028	1.5 mL
Needle nose pliers
Optima XE-90 ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium	Gibco	31985062
OptiPrep density gradient media (iodixanol)	Serumwerk	AXS-1114542	60% iodixanol solution
P1000 Pipet	Gilson	F144059M
P2 Pipet	Gilson	F144054M
P20 Pipet	Gilson	F144056M
P200 Pipet	Gilson	F144058M
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	P0290
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4474
Pipet-Aid XP pipette controller	Drummond Scientific	4-000-101
Plasmid pCapsid	De novo or Addgene, etc.	N/A	We used pACGrh74.
Plasmid pHelper	Addgene	112867
Plasmid pTransgene	De novo or Addgene, etc.	N/A	We used pdsAAV-GFP.
Pluronic F-68 polyol solution (10%)	Mp Biomedicals	92750049
Polyethylene glycol 8000	Research Products International	P48080-500.0
Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max)	Polysciences	NC1038561	Dilute in water to 40 μM
Polypropylene centrifuge tubes, sterile	Corning	431123	500 mL
Polypropylene centrifuge tubes, sterile	Corning	430776	250 mL
Polypropylene Optiseal tubes	Beckman Coulter	361625
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP250-B	50 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP225-B	25 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP210-B	10 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP205-B	5 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV1000	1 L
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV50-0	500 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV250	250 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV12-5	125 mL
Sodium chloride solution (5 M)	Fisher Scientific	NC1752640
Sterile syringes	Fisherbrand	14-955-458	5 mL
Syringe filter	Millipore	SLGV013SL	0.22 micron
Tris-HCl pH 8.5 (1 M)	Kd Medical	RGE3363
Trypan blue solution	Gibco	15250061
Tube rack assembly	Beckman Coulter	361646
Tube spacers (x4)	Beckman Coulter	361669
Tubing for peristaltic pump	Fisher Scientific	14190516
Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor	Beckman Coulter	337922
Ultra low temperature freezer			Set at -70 °C
Vivaspin 20 centrifugal concentrator	Sartorius	VS2041
Water bath			Set at 37 °C