利用光热非共振敲击对 DNA 三点星基序自组装进行高速原子力显微镜成像

摘要

在这里，我们展示了观察生物分子与光热非共振敲击 （PORT） 相互作用的成像方案，其中我们优化了成像参数，确定了系统限制，并研究了成像三点星 DNA 基序组装的潜在改进。

摘要

高速原子力显微镜 （HS-AFM） 是一种流行的分子成像技术，用于实时可视化单分子生物过程，因为它能够在液体环境中的生理条件下成像。光热非共振敲击 （PORT） 模式使用驱动激光器以受控方式振荡悬臂。这种直接悬臂驱动在 MHz 范围内有效。结合在时域力曲线而不是共振振幅上作反馈回路，PORT 能够以高达每秒 10 帧的速度进行高速成像，并直接控制针尖采样力。PORT 已被证明能够对精细的组装动力学进行成像，并精确监测生物分子形成的模式。到目前为止，该技术已用于各种动态 体外 研究，包括本研究中所示的 DNA 3 点星基序组装模式。通过一系列实验，该协议系统地确定了 HS-PORT AFM 成像系统的最佳成像参数设置和极限，以及它们如何影响生物分子组装过程。此外，它还研究了驱动激光器对样品和周围液体引起的潜在不良热效应，特别是当扫描仅限于小区域时。这些发现提供了有价值的见解，将推动 PORT 模式在研究复杂生物系统中的应用。

引言

高速原子力显微镜 （HS-AFM） 是一种快速发展的成像技术 1,2,3,4。它的运行速度使研究人员能够实时可视化生物分子相互作用 5,6,7,8,9。光热非共振敲击 （PORT） 是一种非共振成像模式，类似于峰值力敲击^10,11、脉冲力模式^12,13 或跳跃模式¹⁴。然而，PORT 不是垂直摆动扫描仪，而是仅通过聚焦在悬臂上（通常靠近夹紧点）的激发激光垂直摆动悬臂。悬臂由于双晶片效应而变形：功率调制激发激光器周期性地加热涂层悬臂，由于悬臂和涂层材料的热膨胀系数不同，悬臂会弯曲¹⁵。通过使用在每个振荡周期内定期关闭和重新打开的驱动激光器，而不是使用完整的正弦驱动器⁵，可以最大限度地减少悬臂和样品加热。

DNA 多年来一直被用于形成具有生物学相关性、结构有趣且具有生化意义的基序 16,17,18,19,20。此外，DNA 结构已被证明非常适合表征 AFM 成像质量²¹ 和评估高速 AFM²² 的针尖效应。钝端 DNA 三点星 （3PS） 作为一种可编程模型系统变得实用，用于研究其他复杂生物系统中结构相似的分子的超分子组织¹⁹。以前，通过 HS-AFM²³ 追踪由平末端三聚体 DNA 单体形成的晶格的自组装。最终，这些组织成具有六边形顺序的大型网络。在这里，使用 PORT 技术以足够快的扫描速度对 DNA 3 点星¹⁹ 的自组装进行成像，以跟踪自组装及其校正机制²⁴，同时确保对过程的干扰或样品损伤最小。与任何 HS-AFM 模式一样，在可实现的成像质量、成像速度和样品的不需要干扰之间需要权衡。通过选择正确的折衷方案，人们可以更好地理解超分子组装体的自组织模式。因此，该协议将使用 DNA 3PS 作为模型系统的类似设置来优化特定于 PORT 的参数。这将允许在足够大的扫描尺寸下以快速成像速度运行，同时最大限度地减少样品损伤。

研究方案

1. 样品和缓冲液

注意：本研究中使用的 DNA 瓦片是在普渡大学 毛 实验室开发的 3 点星形基序^19,25。本研究中使用的所有寡核苷酸均购自 Integrated DNA Technologies， Inc.。收集必要的材料和试剂。

1. 在退火缓冲液（5 mM TRIS、1 mM EDTA 和 10 mM MgAc₂）中以 1：3：3 的摩尔比（S1 0.6 μM、S2 1.8 μM，S3 1.8 μM）混合单链 DNA （ssDNA）。DNA 基序的最终浓度必须为 0.6 μM（49 ng/μL，3PS 分子量为 82020.3 g/mol）。
2. 将 DNA 溶液放入耐热容器中，加热至 80 °C。 在 4 小时内将 DNA 溶液从 80 °C 缓慢冷却至 20 °C。该退火过程有助于 ssDNA 寡核苷酸形成所需的双链 DNA 基序。
3. 纯化时，将退火的 DNA 溶液上样到 3% 琼脂糖凝胶上，以去除过量的 ssDNA 和任何不需要的副产物。在含有 0.5x Tris-硼酸盐-EDTA （TBE） 和 10 mM Mg（CH₃COO）₂ 的运行缓冲液中，在 60 V 下运行 3% 凝胶约 2.5 小时。
4. 识别并定位凝胶上包含 DNA 基序的条带。确保表带已根据其大小迁移到特定位置。
5. 小心地从凝胶中切除含有 DNA 基序的条带。将切除的凝胶片段置于凝胶提取离心柱中，并在 3,000 x g 和 4 °C 下离心 10 分钟，从切除的凝胶片段中提取 DNA 基序。
6. 使用离心浓缩器将提取的 DNA 基序中的缓冲液替换为退火缓冲液。在室温下以 3000 x g 离心（或更低），直到浓缩溶液小于 100 μL。然后，加入 300 μL 退火缓冲液并重复此步骤两次以确保更换缓冲液。
7. 将 DNA 基序稀释至 6 nM 用于成像目的。使用分光光度计或其他适当的方法准确测定和调整浓度。DNA 基序现在可以进行成像。
   注：方案中的所有缓冲液的 pH 值为 8.0。三个相应波段的序列信息如下：
   S1： AGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGT
   AGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC
   S2： ACTATGCAACCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGACA
   CGGTAACG
   S3： CGTTACCGTGTGGTTGCATAGT

2. 悬臂尖端生长

1. 悬臂安装在 SEM 悬臂支架上：确保悬臂清洁且无任何污染物。将悬臂安装到与 SEM 系统兼容的合适支架上。定制的悬臂支架设计可根据要求共享。
2. 气体注射：加热前驱体气体（例如，用于无定形碳尖端的菲 C₁₄H₁₀ 前驱体）以用于气体注入系统以生长新尖端。一旦真空度低于 ^10-5 mbar，就吹扫气体注入管路 10 次，持续 2 秒，以确保喷嘴管路中没有不需要的残留空气（必须在枪室的阀门关闭的情况下进行）。
3. 尖端位置调整：使用扫描电子显微镜 （SEM） 定位悬臂的末端。将悬臂支架倾斜到与悬臂放置在 AFM 悬臂支架上时相对于表面呈现的角度（例如，在本例中为 11°）相当，这样生长的尖端在成像时将垂直于表面。调整 SEM 的位置和焦点，以获得悬臂尖端的清晰视图，那里将长出锋利的碳纳米尖端。
4. 聚焦电子束诱导沉积 （FEBID）：
   1. 在所选软件（在本例中为 SmartFIB）上设置沉积参数，例如束流 （I） 和加速电压 （V）、工作距离 （WD）、放大倍率、曝光形状、剂量/沉积时间和停留时间。以下参数用于生长非晶碳针尖，它为 AFM 成像提供了良好的机械性能，导致长度约为 130 nm，半径在 2-4 nm 范围内：
      选择点/点作为曝光形状
      工作距离 = 5 毫米
      I = 78 pA，V = 5 kV
      停留时间 = 1 μs
      剂量 = 0.05 nC，沉积时间 = 0.64 s
      放大倍率 = 20000x
   2. 通过将电子束中的点照射到悬臂尖端上，同时注入前驱体气体，在沉积完成后关闭气体，开始沉积过程以长出尖端。在这种情况下，SmartFIB 软件会在设置上述配方后自动执行此作。
5. 生长后分析：进行生长后 SEM 成像，以检查新生长的尖端并确保其质量和特性（尖端半径和长度）。针尖生长后等待 1-2 分钟，以确保所有前驱体气体都被抽出，以避免在 SEM 成像过程中重新沉积。从 SEM 室中取出样品架。
6. 悬臂回收：如果 SEM 系统还安装了组合聚焦离子束 （FIB），则使用低 FIB 电流（例如 1 pA，以避免悬臂损坏）用 FIB 系统铣削，以去除损坏或脏污的先前生长的尖端。通过从尖端到基部以横截面形式铣削来执行尖端去除，以避免尖端塌陷。这将允许重新种植一个新的。

3. HS-AFM 硬件

1. 成像装置由定制的 PORT 头^5、26（图 1A）、带有顶部云母样品盘的高速扫描仪²⁶、兼容控制器²⁷、具有高速成像所需的高带宽的高压放大器、AFM 底座和带有控制上述设备所需软件的 PC^组成27。
   注意：在这种情况下，这些是开源组件，可以从 EPFL^27、28 的生物和纳米仪器实验室获得计划。还可以参加有关如何构建 PORT 头和控制器²⁹ 的研讨会，以及下载和使用基于 LabView 的软件。
2. 使用镊子小心地将超短悬臂（例如 AC10DS 或同等产品）放在悬臂支架上的弹簧夹下。确保悬臂芯片固定稳定。
3. 使用注射器通过左侧液体进路端口添加 50 μL 液体，如图 1B 所示。在激发激光器仍处于关闭状态的情况下，使用 AFM 头上的三个专用旋钮将读出激光器对准悬臂，如图 1A 所示。通过观察白纸上悬臂的阴影，同时最大化总和（阴影法）来执行此作。然后，使用两个专用旋钮将激光光斑置于光电二极管的中心。
4. 通过选中 Excitation VI 中的 Excitation Enable 框来打开并对齐驱动激光器，使其驱动和摆动悬臂。在连接的示波器上显示悬臂激励信号和悬臂偏转信号。如果偏转振荡太低（或不存在），则可能是驱动激光器离悬臂很远。在这种情况下，请使用阴影方法并关闭偏转激光器，以便于对准。使用 图 1A 所示的驱动激光调节旋钮最大化振荡幅度。
5. 要调整 PORT 中的悬臂振荡幅度，请在软件的相应控制中输入发送到半导体激光管控制电路（从现在开始，峰峰值交流输入）的峰峰值电压 激励 VI。为了使半导体激光管保持导通状态，从而保持激光束，向半导体激光管控制电路添加直流电压（从现在开始，直流偏移输入），这也是从激励 VI 中的配置框中完成的。两者都会影响激光功率，激光功率可以用激光功率计测量，用于调整悬臂振荡幅度。
6. 确定可以施加到悬臂的最大光热激发频率，该频率必须低于悬臂的谐振频率。通过热调谐或频率扫描来确定谐振频率。本研究中使用的悬臂 （AC10DS） 在液体中的共振频率约为 400 kHz（空气中为 1 MHz）³⁰，其准静态弯曲区域低于 300 kHz⁵。因此，必须使用低于该限值（约 100-200 kHz）的 PORT 频率。
7. 将 PORT 速率和扫描速率的成像参数和设置分别调整为激发和扫描可见光中的所需值（本文中使用的参数在图描述中说明）。配置设置和成像参数后，执行所需的成像实验以观察和跟踪分子相互作用。
   注意：由于 AC10DS 悬臂不再销售，因此可能需要使用 Fastscan D 或 BioLever³¹ 等替代品，直到有等效的悬臂可用。

4. 获得适当的交互曲线

1. 最初，通过单击设置为接触模式的 Z 控制器 VI 上的“开始”，以接触模式接近样品表面。
   1. 在这种模式下，AFM 针尖与样品直接接触。到达表面后，在 Ramp VI 中执行力与距离曲线，以获得悬臂偏转灵敏度校准。
   2. 此外，根据悬臂提供程序规格（不太准确）、使用干涉仪获得或通过偏转灵敏度校准后的基于热调谐的校准来估计悬臂弹簧常数。精确的悬臂校准对于精确的针尖样品力控制至关重要。
2. 通过单击Z控制器VI中的 “向上 ”，将Z压电陶瓷从尖端无法到达表面的表面完全缩回后，在Z控制器VI中切换到 PORT 模式，然后在“激发VI”复选框中打开激发激光器。首先，使用 AC10DS 悬臂将 PORT 模式设置为在激励 VI 中以所需的频率运行，在本例中为 100 kHz。
3. 记录无悬臂振荡，但不要接触表面。然后，将 Z 控制器中的 Feedback 打开 与要记录的表面接触，然后单击 Correct 以获得悬臂与表面间歇性接触时的悬臂振荡，均以纳米为单位。从间歇接触曲线中减去自由振荡曲线以获得真实的相互作用曲线，并使用悬臂弹簧常数（在本例中为 0.1 N/m）将它们转换为 pN。

5. HS-AFM 成像

1. 制备浓度为 10 mM 的 Mg（CH₃COO）₂ 溶液。使用 Hamilton 注射器，将 50 μL 制备好的 10 mM Mg（CH₃COO）₂ 溶液注入悬臂支架的流体通道中，形成一滴包裹悬臂的液体。
2. 通过单击Z控制器VI上的 开始 ，逐渐将悬臂接近表面。检测到表面后， 打开反馈，并在 ORT 力曲线 VI 中找到相互作用曲线的峰值。找到允许正确跟踪的最低力设定点（低于 300 pN 以避免损坏脆弱的生物样品）。
3. 将扫描 VI 中的 扫描大小 设置为 800 nm x 800 nm，将 线速 设置为 100 Hz。单击扫描 VI 中的 帧 （向下）箭头扫描表面，检查表面质量。如果检测到任何污染，请在继续作之前通过清洁表面、悬臂和/或悬臂支架来解决问题。
4. 扫描后，单击 Z 控制器 VI 中的 “撤回 ”，将悬臂从表面缩回。用 Hamilton 注射器从悬臂支架的孔中取出缓冲溶液，以防止出现死体积问题。
5. 从实验步骤的第 1 部分制备稀释的 DNA 3PS 溶液。将 50 μL 稀释的 DNA 3PS 溶液注入悬臂支架的专用通道中。
6. 通过重复步骤 5.2-5.3 开始成像过程，以 100 Hz 的默认线速（256 行× 256 像素）扫描 800 nm x 800 nm 区域。初始扫描后，将 Scan VI 中的成像大小和速度调整为指定值，以便进一步采集数据。
7. 除非另有说明，否则将 Z 控制器 VI 设定点 框中针尖-样品相互作用的输入力设定值保持在正确跟踪所需的最低水平（低于 300 pN），以最大限度地减少样品损坏/干扰。对所有必需的样品区域重复此过程。

6. 图像处理

1. 设置运行自定义 Pygwy （Python for Gwyddion） 批处理代码的环境，确保 Python 和所有必要的库。更多信息可以在 Gwyddion 的网站上找到³² 已正确安装在系统上。这可确保代码平稳运行并可以访问所需的功能。
2. 打开自定义的 Pygwy 批处理代码（应要求提供）。这将提供对图像处理和分析所需的工具和功能的访问权限。
3. 通过对图像执行水平中线校正来开始图像处理。此步骤旨在消除扫描线中存在的任何不规则或伪影，确保后续处理步骤基于准确的数据。去除平面背景后，应用线条校正。使用疤痕去除功能通过消除由外部因素引起的任何不需要的痕迹或瑕疵来进一步增强图像。此步骤可改善图像的整体视觉外观。
4. 通过调整颜色高度图来增强图像的可见性和对比度。这可确保感兴趣的特征清晰可见并在图像中脱颖而出。
5. 选择需要合并为视频的处理图像。确定视频所需的帧速率。在这种情况下，请将其设置为每秒 7 帧 （fps）。
6. 计算每帧的持续时间。使用 Fiji （ImageJ） 将处理后的图像合并为视频。确保帧速率和帧持续时间设置正确。

结果

在这项研究中，利用 HS-PORT AFM 的功能成功观察到了 DNA 3 点星形基序向稳定岛的动态组装过程。这项技术使我们能够实时捕捉这些结构的组装。在 图 2A、B 中，我们分别以 100 Hz 和 200 Hz 的线速获得清晰的图像扫描，对于 100 kHz 端口速率（800 nm x 800 nm 扫描尺寸）。这分别对应于每个像素 3.9 和 1.95 个振荡周期。然而，在不同时增加 PORT 速?...

讨论

在对精细的生物样品进行成像时，AFM 中的非共振敲击成像模式特别有用，因为它们可以直接控制针尖-样品相互作用力¹⁰。其中，PORT 模式因其可以达到更高的振荡率而脱颖而出，从而实现更高的扫描率。由于 PORT 直接且仅用激光驱动悬臂，因此它允许以比传统的非谐振轻敲模式高得多的频率进行激励，尤其是在使用具有高谐振频率的超短悬臂时

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AC10DS	Olympus	BL-AC10FS-A2	Discontinued
Biometra Compact XS/S	Biometra GmbH	846-025-199	Electrophoresis  unit
Biometra TRIO	Biometra GmbH	207072X	thermocycler for annealing
Custom AFM setup	Laboratory for Bio-Nano Instrumentation, Interfaculty Bioengineering Institute, School of Engineering, Ecole Polytechnique Fédérale Lausanne		Obtainable through Laboratory for Bio-Nano Instrumentation
EDTA	ITW Reagents	A5097	In annealing buffer
Laser Power Meter	Thorlabs	PM100D	Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console
Lively 3AP Power Supply, MP-310	Major Science	MP-310	Electrophoresis Power Supply
MgAc2	ABCR GmbH	AB544692	In annealing buffer
TBE	Thermo Scientific	327330010	Running buffer for electrophoresis
TRIS	Bio-Rad	1610719	In annealing buffer