穿刺伤口止血和蒙太奇广域电子显微镜分析样品的制备

摘要

本文将介绍止血血栓形成的穿刺伤口操作方法。形成的血栓很大，直径为数百微米。因此，体积成像方法是合适的。我们建议将蒙太奇广域透射电子显微镜作为许多人可用的高分辨率方法，并详细介绍了制备方案。

摘要

止血是对血管损伤进行正常生理控制的过程，是人类生活的基础。我们都会不时遭受轻微的割伤和刺伤。在止血中，自限性血小板聚集导致形成结构化血栓，其中止血来自从外部封住孔。这种结构的详细表征可能会导致止血和血栓形成之间的区别，血栓形成是血小板过度聚集导致闭塞性凝血的情况。这里提出了一种基于成像的穿刺伤口血栓结构方法，该方法利用薄层电子显微镜的能力来可视化止血血栓的内部。任何基于成像的实验方案中最基本的步骤是良好的样品制备。该协议提供了为小鼠准备穿刺伤口和富含血小板的血栓以进行后续电子显微镜检查的详细程序。给出了形成穿刺伤口血栓的 原位 固定及其后续处理以进行电子显微镜染色和包埋的详细程序。电子显微镜被介绍为末端成像技术，因为它能够在与顺序切片相结合时，以高分辨率可视化血栓内部的细节。作为一种成像方法，电子显微镜提供无偏采样和在 2 或 3 维中从纳米到毫米的实验输出。引用了适当的免费电子显微镜软件，该软件将支持广域电子显微镜，其中数百个框架可以混合，以提供整个穿刺伤口血栓横截面的纳米级成像。因此，图像文件的任何子区域都可以很容易地放入完整横截面的上下文中。

引言

形成穿刺伤口血栓导致止血是生活中最重要的事件之一¹。然而，尽管具有这种必要性，但对血栓形成过程中结构变化的了解，无论是在静脉、动脉、动脉粥样硬化事件还是闭塞性凝块中，都受到分辨率和成像深度的限制。与完全形成的穿刺伤口血栓相比，传统的光学显微镜在深度上受到限制，在 Z¹ 中为 200 至 300 μm，与血小板细胞器的大小及其间距相比，分辨率水平有限，通常小于 30 nm²。双光子光学显微镜可以产生所需的成像深度，但不会显著提高分辨率。光学显微镜的最新进展，例如超分辨率技术，仍然受到分辨率限制，实际上 XY 为 ~20 nm，Z 轴为 20 nm，深度有限，不超过传统光学显微镜。此外，与许多研究用光学显微镜一样，超分辨率光学显微镜基于荧光显微镜，这种技术本质上偏向于一小部分存在良好抗体或良好标记构建体的候选蛋白质³。总之，传统的扫描电子显微镜最多只能看到形成的富含血小板的血栓的表面。

为了克服这些技术限制来表征血栓结构，我们有三个目标。首先，在小鼠静脉或动脉中可重复地产生明确的穿刺伤口，然后可以通过化学固定轻松原位稳定。其次，应用强调膜保存的制备程序，这一目标与定义形成血栓中单个血小板的位置的目标一致。第....

研究方案

实验由阿肯色大学医学科学研究所动物护理和使用委员会 （IACUC） 审查和批准。在这里，使用了 8 - 12 周龄的野生型雄性和雌性 C57BL/6 小鼠。这些小鼠是脂肪积累很少的年轻成年人。相同的程序适用于对止血很重要的各种蛋白质的小鼠突变体，例如 von Willebrand 因子或血小板糖蛋白 VI （GPVI）^5,6。使用的所有设备、手术器械、试剂和其他材料如图 1 所示，并列在材料表中。

1. 颈静脉/股动脉穿刺伤口 ^1,7

1. 小鼠麻醉
   1. 将鼠标置于诱导室中，将异氟醚蒸发器调至高流速设置（500 mL/min，3% 异氟醚）。选择异氟醚是因为它对血管直径的影响很小。
      注意：长期接触异氟醚会对健康造成不利影响。使用低流量蒸发器、麻醉气体捕获罐和良好的室内通风可以大大减少暴露。
   2. 当鼠标似乎处于睡眠状态时，捏住鼠标的一个脚趾，看看鼠标是否有反应。如果是这样，....

讨论

我们提出了一种详细的穿刺伤口程序，用于在颈静脉和股动脉中产生止血血栓、它们的 原位 灌注固定以及蒙太奇广域透射电子显微镜的样品处理。整个程序可用于生成止血血栓以进行超微结构分析和比较实验小鼠的出血时间，例如，用不同类型和剂量的药物治疗的小鼠。它还可用于比较对照野生型小鼠的出血时间与敲除小鼠的出血时间（即，血小板中与粘附配体?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal Saline Solution	Medline	BHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint scalp vein set	Medline	NDA26709
30G x 1/2 EXELint hypodermic needles	Medline	NDA264372
33G x 1/2 EXELint specialty hypodermic needles	Medline	NDA26393
50 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	06-443-20
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090670Z
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-100
Animal Heating Plate	Physitemp Instruments	HP-1M
Araldite GY 502	Electron Microscopy Sciences	10900
Axiocam 305 Color R2 Microscopy Camera	Carl Zeiss Microscopy	426560-9031-000
BD Luer-Lok Syringes, 20 mL	Medline	B-D303310Z
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
Cell Culture Dishes 35mm x 10mm	Corning Inc.	430165
Cotton Tipped Applicators	Medline	MDS202055H
DMP-30 Activator	Electron Microscopy Sciences	13600
Dodecenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron Microscopy Sciences	13700
Dressing Forceps, 5", curved, serrated, narrow tipped	Integra Miltex	6-100
Dressing Forceps, 5", standard, serrated	Integra Miltex	6-6
EMBED 812 Resin	Electron Microscopy Sciences	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron Microscopy Sciences	15055
Fisherbrand 4-Way Tube Rack	Fisher Scientific	03-448-17
Fisherbrand Digital Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Fisherbrand Single Syringe Infusion Pump	Fisher Scientific	7801001
Gauze Sponges 2" x 2"- 4 Ply	Medline	NON26224H
Glutaraldehyde (10% Solution)	Electron Microscopy Sciences	16120
Isoflurane Liquid Inhalant Anesthesia, 100 mL	Medline	66794-017-10
Jeweler-Style Micro-Fine Forceps, Style 5F	Integra Miltex	17-305	Need 2 pairs.
L/S Pump Tubing, Silicone, L/S 15; 25 Ft	VWR	MFLX96410-15
L-Aspartic Acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
Malachite Green 4	Electron Microscopy Sciences	18100
Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head	VWR	MFLX77200-62
Masterflex L/S Variable Speed Digital Drive	VWR	MFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Wire Cutters	Fisher Scientific	50-191-9855
Osmium Tetroxide 4% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde (16% Solution)	Electron Microscopy Sciences	15710
Physitemp Temperature Controller	Physitemp Instruments	TCAT-2LV
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene Oxide, ACS Reagent	Electron Microscopy Sciences	20401
Pyrex Glass Beakers	Fisher Scientific	02-555-25B
Rectal Temperature Probe for Mice	Physitemp Instruments	RET-3
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"	3M Company	305289
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11623
SomnoFlo Low Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01
SomnoFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	SF-MSEKIT
Stainless Steel Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Stereomicroscope steREO Discovery.V12	Carl Zeiss Microscopy	495015-9880-010
Sylgard 184 Silicone Elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	silicone mat
Tannic Acid	Electron Microscopy Sciences	21700
Thiocarbohydrazide (TCH)	Sigma-Aldrich	88535
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vannas Spring Micro Scissors	Fine Science Tools	15000-08
Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", Curved, Serrated	Integra Miltex	18-818	Need 2 pairs.
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Wahl MiniFigura Animal Trimmer	Braintree Scientific	CLP-9868
Zen Lite Software	Carl Zeiss Microscopy	410135-1001-000