使用自动三维神经元重建软件进行树突状脊柱定量

摘要

树突棘是大多数兴奋性突触的突触后隔室。树突状脊柱形态的改变发生在神经发育、衰老、学习以及许多神经和精神疾病的过程中，这强调了可靠的树突状脊柱分析的重要性。该协议描述了使用自动三维神经元重建软件准确且可重复地量化树突棘形态。

摘要

突触连接允许神经元之间交换和处理信息。兴奋性突触的突触后部位通常形成于树突棘上。树突棘是以突触可塑性、神经发育以及神经和精神疾病为中心的研究中非常有趣的结构。树突棘在其生命周期中会发生结构修饰，其特性（如脊柱总数、树突棘大小和形态学定义的亚型）会随着不同的过程而变化。描述调节树突棘这些结构改变的分子机制依赖于形态学测量。这需要准确且可重复的树突棘分析来提供实验证据。本研究概述了使用 Neurolucida 360（自动三维神经元重建软件）进行树突棘定量和分类的详细方案。该协议允许确定关键的树突状脊柱特性，例如总脊柱密度、脊柱头部体积和脊柱亚型的分类，从而能够有效分析树突状脊柱结构表型。

引言

树突棘是树突的突起，通常包括谷氨酸能突触的突触后部位 ^1,2。树突棘在突触可塑性领域特别有趣。当突触强度发生变化时，棘通常会发生变化，在长期突触增强时变得更大更强，在长期突触抑制中变得更小更弱 3,4,5,6,7。除了突触可塑性之外，树突棘的轮廓在整个生命周期中都会发生变化。在早期发育中，有一段树突状脊柱形成和生长的时期，然后是树突状脊柱修剪，直到达到稳定状态 ^8,9,10。在衰老的大脑中，脊柱缺失伴随着大脑萎缩和认知能力下降¹¹。此外，许多神经、神经退行性和精神疾病的特征是异常的树突棘。受精神分裂症影响的个体的多个大脑区域的树突棘较少，可能是由于突触修剪改变所致¹²。自闭症谱系障碍也以树突状脊柱病变为特征¹³。树突状脊柱缺失是阿尔茨海默病和帕金森病的标志^14,15。鉴于研究主题广泛，包括对树突状脊柱特性的研究，准确定量脊柱的技术至关重要。

染色，即高尔基体法，或通过染料填充或表达荧光蛋白标记神经元是树突状脊柱可视化的常用方法 16,17,18。可视化后，可以使用各种免费和市售软件客户端对 spine 进行分析。分析的预期结果是决定哪种软件最有用的重要因素。斐济是解决以树突棘密度为中心的问题的可行软件选项。然而，这种技术在很大程度上依赖于耗时的手动计数，这可能会引入潜在的偏差。SpineJ 等新插件允许自动定量，此外还允许更准确的脊柱颈部分析¹⁹。这些方法的一个缺点是丢失了用于确定脊柱体积的三维分析，因为 SpineJ 仅限于二维图像堆栈。此外，通过这些过程获取脊柱亚型信息变得具有挑战性。四种主要的脊柱亚型，薄、蘑菇、粗短和丝状伪足，都意味着单独的功能，并且主要通过形态学分类²⁰。细刺的特点是细长的脖子和清晰的头部²¹。蘑菇刺有一个更大而明显的刺头²²。粗短的刺很短，头部和颈部之间几乎没有差异²³.丝状伪足是未成熟的棘，脖子细长，没有明显可观察到的头部²⁴。虽然分类提供了有价值的信息，但 spine 存在于维度的连续体上。分类基于形态测量范围^25,26。在这种方法中，手动测量棘以进行分类会加剧研究人员的后勤负担。

其他专门针对三维树突状脊柱分析的软件选项更适合研究脊柱体积和亚型属性 27,28,29,30,31。尽管三维分析存在困难，例如 z 平面分辨率差和拖尾，但这些软件选项允许以用户引导的半自动方式可靠地重建树突和树突棘。将识别出的脊柱自动分类为其亚型也是其中一些脊柱分析软件包中的一个功能。这可以减轻对潜在工作量和实验偏倚的担忧。Neurolucida 360 是一种市售软件，可实现可靠且可重复的三维树突棘识别和分类³²。在这里，我们提出了一个全面的协议，以有效地准备固定组织、获取图像，并最终使用该软件对树突棘进行量化和分类。

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研究方案

所有动物程序均遵循美国国立卫生研究院在校内研究中使用动物指南，并得到美国国家心理健康研究所动物护理和使用委员会的批准。

1. 固定海马切片的制备

1. 通过腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪（氯胺酮:100 mg/kg;甲苯噻嗪:8 mg/kg）。通过捏尾验证麻醉并将鼠标贴在灌注板上。
2. 使用大型手术剪刀去除胸部的皮肤和毛皮，以便更容易地看到下面的胸腔。
3. 在胸腔宽度以下进行水平切割，避开肝脏和隔膜。使用细镊子，向上拉剑突并切开胸腔的每个外侧。将胸腔向上翻转到颈部区域，并使用止血钳夹住到位。
4. 将 21 G 蝶针插入心脏左心室，开始以大约 5 mL/min 的速度灌注室温 1x PBS。用小手术剪刀在右心房上做一个小切口。用 PBS 灌注，直到离开心房的溶液变清。
5. 关闭灌注泵，确保没有气泡进入管路。将 PBS 中的管路放入冰冷的 4% 多聚甲醛 （PFA） 中的 PBS 中。以 5 mL/min 的速率灌注 PFA，直到动物完全变硬，大约 25 mL。
   注意:确保 PFA 是新鲜的（如果原液储存在 1°C 下，则不超过 4 周）以实现最佳固定。
6. 用小手术剪刀从颅骨表面去除皮肤。用小手术剪刀沿着颅骨的中央裂缝做一个矢状中段的切口。在嗅球和小脑上方进行侧切。
7. 用细镊子打开头骨，露出大脑。用抹刀轻轻地从嗅球中舀出大脑，并放入 4% PFA 的 PBS 中过夜。
   注:有关啮齿动物灌注的更全面方案，请参阅 Gage 等人 ³³。
8. 用 PBS 中的 15% 蔗糖代替 4% PFA 冷冻保护固定脑 1 天。在此之后，用 PBS 溶液中的 30% 蔗糖替换 15% 蔗糖 1 天，直到大脑沉入溶液中。
9. 从蔗糖溶液中取出大脑，并将其放入含有 PBS 的培养皿中。使用手术刀片切掉小脑和嗅球。
10. 在试样夹具座表面放置少量直径为 1-2 cm 的最佳切割温度化合物 （OCT）。将大脑冠状安装到标本架上，尾部切割面在 OCT 中。将标本架放入粉碎的干冰中直至明显冻结，快速冷冻大脑，大约 5-7 分钟。
11. 确保低温恒温器的叶片角度设置在 0° 到 5° 之间，以产生均匀的切片。调整卷板角度以实现最佳切片展平效果。具体说明请参阅设备手册。
12. 将标本架放入低温恒温器中，使大脑的腹面最靠近刀片。将大脑切成 30 μm 的背侧海马切片，丢弃海马体喙部的所有切片。
    注意:协议的这一部分可以适应任何所需的大脑区域选择。步骤 1.9-1.12 将根据感兴趣的区域而变化。
13. 将背侧海马切片转移到 PBS。使用画笔，轻轻地将海马切片安装在显微镜载玻片上。用棉签或精致的任务湿巾去除任何多余的溶液。
14. 将 100 μL 硬固封固剂涂抹在覆盖所有脑切片的显微镜载玻片上。为防止气泡，使用镊子将盖玻片缓慢降低到封固剂上。如果形成气泡，请用镊子轻轻敲击盖玻片，让它们逸出。成像前让载玻片凝固过夜。

2. 高分辨率共聚焦成像

1. 使用低放大倍率目镜识别荧光细胞。切换到 63x （NA = 1.4） 或更高的物镜，在物镜上涂抹适当的浸没介质。
   注:为获得最佳结果，请使用具有 63 倍或更高物镜的激光扫描共聚焦显微镜。
2. 识别标记良好的树突节段，重叠有限，用于图像采集。设置激光功率和增益以确保荧光树突不饱和。此外，降低扫描速度可以提供更好的图像分辨率。
3. 获取包含完整树枝状段的 z 堆栈，以供将来分析。大于 10 μm 的 Z 堆栈是不可取的，因为 z 平面中树突重叠的可能性会增加。
   注:使用可用的最小 z 步长 （0.2-0.7 μm） 和 1 个通风单元针孔尺寸。较小的步长会导致 z 堆栈中的图像更多，从而补偿许多显微镜有限的 Z 分辨率。
4. 可选:如果可用，请利用显微镜的相应反卷积软件功能对图像进行反卷积。这将允许更高分辨率的图像。

3. 树突棘定量

1. 打开 Neurolucida 360（v2022.1.1 或更高版本）。在脊柱分析软件中打开图像文件 （File > Open > Image）。确保图像文件在主窗口和 3D 环境中可见。如果 3D 环境 窗口未出现，请在 Trace 选项卡的主窗口顶部工具栏中的 3D Environment 上单击鼠标左键（补充图 1）
   注意:该协议的这一部分可以适用于任何树突状图像，而不仅仅是来自小鼠组织的树突。
2. 在 3D Environment （3D 环境） 窗口的 Change Image Display （更改图像显示） 选项卡中，确保图像在 Display Image As （显示图像为） 框中显示为 3D 体积。在 Image 选项卡的 Image Stack Settings 框中，选择 Max Projection 在 Show Surface As 下拉菜单中。（补充图 2）
3. 确定适合追踪的树突段。
   1. 左键单击 3D Environment （3D 环境） 窗口顶部工具栏中的 Move Pivot Point （移动枢轴点） 工具。左键单击所需的树突以设置新的枢轴点。这将更改方向以启用有效的放大。
   2. 通过左键单击 Reset Orientation 图标重新建立原始方向。设置轴心点后，左键单击 Move Pivot Point 工具开始描摹树突。（补充图 2）。
      注意:理想的枝晶是与任何坐标平面中的其他枝晶重叠有限且不与另一个枝晶相交或与下面的另一个枝晶表面相交的枝晶。在 XY 平面中与其他树突较近的树突也更可取，以防止将相邻的树突不恰当地分配给被追踪的树突。还必须注意的是，不同厚度、顺序和与胞体距离的树突具有不同的树突棘密度^34,35。这需要在实验设计中加以考虑。厚度为 <1.5 μm 的二级树突是示踪的理想选择（图 1）。
4. 左键单击 3D Environment 窗口的 Tree 选项卡。左键点击 User-Guided 作为追踪模式，左键点击 Directional Kernels 作为 User-Guided Tracing Options 中的方法。
5. 当出现圆形内核时，左键单击树突以开始跟踪。沿树突段移动光标。这将自动填充内核。如果内核没有自动填充，请参阅步骤 3.51。
   1. 在树突上轻轻地来回移动光标，直到填充内核。左键单击可保留检测到的现有内核。如果内核停止填充，则当内核在树突的进一步下方填充时，单击鼠标左键以手动放置一个内核。右键单击以结束跟踪。确保追踪的枝晶长度至少为 7 μm（补充图 3）。
6. 通过左键单击并拖动 3D 环境 窗口，使用 3D 环境的所有三个方向（俯仰、偏航和滚动）验证树枝状追踪的准确性。确定树枝状描摹位于树突上适当位置之外的点。在某些情况下，它看起来从上到下都是准确的，但在 z 维度中，这些点不在树枝晶上（图 2）。
7. 要更正未正确跟踪的树突段，请左键单击 Tree （树） 菜单中的 Edit （编辑） 选项卡。左键单击感兴趣的树突，然后左键单击 Points。
8. 通过单击和拖动将放置不当的点移回树枝线段上。通过左键单击点并单击 Delete 按钮来删除无关的点。如果树枝突未充分填充，请更改点的大小。要更改点的大小，请左键单击一个点并调整厚度滑块以更改大小（补充图 4）。
   注意:填充不足的树突会导致识别作为树突节段组成部分的假刺。相反，过度填充的树突会掩盖真正的书刺。
9. 在继续进行步骤 3.10 中的书脊识别之前，对图像中的多个树突重复步骤 3.3-3.8。
10. 左键单击 3D Environment （3D 环境） 窗口中的 Spine （主干） 选项卡。设置 Outer Range、Minimum Height 和 Minimum Voxel Count 的检测设置。根据准备工作的不同，在有明确和具体的更改理由的情况下，可能需要更改预设值。预设条件为"外部范围":2.5 μm，"最小高度":0.3 μm，"最小体素数":10 个体素。
    注:不同的准备工作，例如细胞培养物与急性组织，以及不同的发育时间点将需要不同的标准，这些标准必须从现有文献中得出。同样重要的是要注意，更改检测设置可能会显著改变结果。例如，较高的最小高度可以排除短刺。检测设置必须在整个实验过程中保持一致。
11. 将 Detector Sensitivity 设置为 70%，然后左键单击 Detect All。这将填充所有树突上由此检测器灵敏度识别的棘。如果需要以树突特定的方式选择树突，请左键单击单击 图像以检测最近分支上的所有树突框， 然后左键单击具有不同检测器灵敏度的每个树突。
    注意:在这个阶段，并非所有树突棘都会填充是正常的。同样，非 spine 可能会不正确地填充。最初的 70% 灵敏度也很灵活;这可能会根据准备情况而改变。
12. 通过在所有三个方向上单击并拖动树突来检查此检测器灵敏度选择的刺。如果检测到的大多数骨架未完全填充，请继续执行步骤 3.12.1。如果检测到的书脊已过度填充，请继续执行步骤 3.12.2。如果检测到的棘似乎已充分填充，请继续执行步骤 3.13。
    1. 将 Detector Sensitivity 提高 5%-10%，然后再次左键单击 Detect All 。这将以更高的灵敏度将以前检测到的所有棘替换为新棘。根据需要重复，直到检测到的棘被充分填充。
    2. 将 Detector Sensitivity 降低 5%-10%，然后再次左键单击 Detect All （全部检测 ）。这将用较低敏感度的新棘替换以前检测到的所有棘。根据需要重复，直到检测到的棘被充分填充。
13. 在 3D 环境的 Spine 选项卡中单击左键单击 Keep Existing Spines。如果已选择 Click Image to Detect All on Nearest Branch，请取消选择它。
    注意:通过选中 Keep Existing Spines（保留现有刺）， 可以确保手动新识别的树突刺不会覆盖以前识别的刺。确保在继续之前选中此框，以免覆盖以前的工作。
14. 左键单击 Move Pivot Point 并左键单击需要进一步检测树脊以设置枢轴点的树突。
    1. 取消选择 Move Pivot Point （移动枢轴点）。识别未填充的树突棘。将 探测器灵敏度 提高 10%-20%，然后左键单击脊柱。如果检测到的书脊填充不足或填充过多，请继续执行步骤 3.14.3 或 3.14.4。如果主干未填充，则会显示消息 Unable to detect a spine at the selected location 。在这种情况下，请继续执行步骤 3.14.2。
    2. 逐渐增加 检测器灵敏度 ，可能超过 100%，直到检测到书脊并充分填充。如果检测到脊柱但填充不足，请继续执行步骤 3.14.3。如果书脊填满，请继续执行步骤 3.14.4（图 3）。
    3. 左键单击 Edit 选项卡，然后左键单击填充不足的书脊。左键单击 Remove （删除）。取消选择 Edit 选项卡。将灵敏度提高 5%-10%，然后左键单击脊柱。如果书脊仍然填充不足，请重复此步骤。
    4. 左键单击 Edit 选项卡，然后左键单击过度填充的书脊。左键单击 Remove （删除）。取消选择 Edit 选项卡。将灵敏度降低 5%-10%，然后单击书脊。如果书脊仍然填满，请重复此步骤。
15. 重复步骤 3.14-3.14.4，直到检测到通过视觉识别识别的所有棘。仔细检查树突中是否存在属于相邻树突的任何刺、对应于无真实信号的假刺或可能被错误标记为刺的树突段。使用 Remove 功能删除这些假主刺。
16. 检查树突上已识别的棘。在某些情况下，多个 spine 可能显示为一个砾岩 spine。如果一个书脊似乎包含两个，请左键单击 Edit 选项卡。左键单击书脊，然后左键单击 Hide Selection。确认企业主干后，在 Edit （编辑 ） 选项卡中，左键单击 Show Selection （显示选择 ） 并选择 Split （拆分）。如果一个砾岩中有两个以上的棘，则可能需要重复此步骤（图 4）。
    注意:如果砾岩主干在步骤 3.16 后没有分裂，请删除主干 。然后以较低的灵敏度选择砾岩中更强烈的脊柱。一旦填充了更强烈的棘，就提高灵敏度以选择另一个未填充的棘。或者，删除 conglomerate spine 然后提高灵敏度可能允许正确拆分。
17. 在检测并适当填充所有视觉上可识别的棘后，在 Spine 选项卡中，左键单击 Classify All 将棘分为四个子类型:薄、蘑菇、短和丝状伪足（图 5）。
    注意:Spine 分类参数可以在 Spine 选项卡的 Classification 框的 Settings 窗口中更改。与检测器设置一样，强烈建议更改现有参数的明确理由。预设值为头颈比:1.1，长头比:2.5，蘑菇头大小:0.35 μm，丝足长度 - 3 μm。
18. 在 3D Environment （3D 环境） 窗口的顶部工具栏中，选择 Save and View in Neurolucida Explorer（在 Neurolucida 资源管理器中保存并查看）。Neurolucida Explorer 是从追踪中收集数据的地方。该作品将保存为包含所有描摹和骨架的 .dat 文件。
19. 在 Explorer 窗口的 View 选项卡中，左键单击 Select All 以突出显示所有树突和骨架。
20. 左键单击上方工具栏中的 Analyze 选项卡。左键单击 Structure 下拉菜单。左键单击 Branched Structure Analysis。
21. 根据感兴趣的变量，可以选择任何分析。对于以 spine density 和 average spine volume（平均书脊体积）为中心的问题，最有用的两个方法是 Each Tree > Each Dendrite 和 Spines > Spines Details（ 每个树 树突详细信息）。选择 "确定"，数据将显示在两个单独的窗口中。
22. 将数据复制到电子表格中，以便进一步编译和分析。
    注意:单个树将由树突分隔，但 spine 体积不会。使用电子表格中的 sort 功能，可以按特征过滤 spine 详细信息。

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结果

有效利用这种分析方法从选择树突段进行追踪开始。如图 1 所示，用于描摹的理想树突并不靠近其他树突。并行运行的树突可能会导致无法正确识别来自相邻树突的书脊。树突在不同的 z 平面中直接相交或垂直延伸，也大大增加了准确的树枝状追踪的难度。注意枝晶厚度的差异也很重要。如前所述，不同厚度的树突的脊柱密度存在关键差异

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讨论

该协议详细介绍了样品制备、成像以及使用三维重建软件对树突棘进行定量和分类的过程的具体步骤。该软件是一个强大的工具，能够生成强大的结构数据，有助于各种研究。在整个过程中，有一些关键步骤可以减轻该协议的方法负担并提高数据的整体输出。标记树突棘的方法是研究人员在开始该协议之前首先应该考虑的事情之一。标记方法不足可能会导致脊柱定量问题...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
518F Immersion Oil	Zeiss	444960-0000-000
Cryostat	Leica	CM3050S	For slice preparation
Fine Forceps	FST	11150-10
Hemostat Forceps	FST	13020-12
Large Surgical Scissors	FST	14002-16
LSM 880 Confocal Microscope	Zeiss	LSM 880
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-541-035
Mini-Peristaltic Pump II	Harvard Apparatus	70-2027	For perfusions
Neurolucida 360	MBF Bioscience	v2022.1.1	Spine Analysis Software
Neurolucida Explorer	MBF Bioscience	v2022.1.1	Spine Analysis Software
OCT Compound	Sakura Finetek	4583	For cryostat sectioning
Paraformaldehyde (37%)	Fisherbrand	F79-1
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC	Zeiss	440762-9904-000
Scalpel Blade	FST	10022-00
Small Surgical Scissors	FST	14060-09
Spatula	FST	10091-12
Sucrose	FIsherbrand	S5-500
Superfrost Plus Microslides	Diagger	ES4951+
Vectashield HardSet Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1400-10