基于大肠杆菌的互补测定研究热休克蛋白的伴侣功能 70

摘要

该方案证明了热休克蛋白70（Hsp70）的伴侣活性。 大肠杆菌 dnaK756 细胞可作为测定的模型，因为它们含有天然的、功能受损的 Hsp70，使其容易受到热应激的影响。功能性 Hsp70 的异源引入挽救了细胞的生长缺陷。

摘要

热休克蛋白 70 （Hsp70） 是一种保守的蛋白质，可促进细胞内其他蛋白质的折叠，使其成为分子伴侣。虽然 Hsp70 对于在正常条件下生长的大 肠杆菌 细胞不是必需的，但这种伴侣对于在高温下生长是必不可少的。由于 Hsp70 是高度保守的，因此研究来自不同物种的 Hsp70 基因伴侣功能的一种方法是在大肠杆菌菌株中异源表达它们，这些 菌 株要么缺乏 Hsp70，要么表达功能受损的天然 Hsp70。 大肠杆菌 dnaK756 细胞不能支持噬菌体 DNA。此外，它们的天然 Hsp70 （DnaK） 表现出升高的 ATP 酶活性，同时表现出对 GrpE（Hsp70 核苷酸交换因子）的亲和力降低。因此， 大肠杆菌 dnaK756 细胞在 30 °C 至 37 °C 的温度范围内充分生长，但它们在高温 （>40 °C） 下死亡。出于这个原因，这些细胞可作为研究 Hsp70 伴侣活性的模型。在这里，我们描述了应用这些细胞进行互补测定的详细方案，从而能够研究 Hsp70 的纤维素 伴侣功能。

引言

热休克蛋白通过促进蛋白质折叠、防止蛋白质聚集和逆转蛋白质错误折叠，发挥着分子伴侣的重要作用 ^1,2。热休克蛋白 70 （Hsp70） 是最突出的分子伴侣之一，在蛋白质稳态中起着核心作用 ^3,4。DnaK 是大肠杆菌 Hsp70 同源物⁵。

已经开发了各种生物物理、生化和基于细胞的测定法来探索 Hsp70 的伴侣活性并筛选靶向该伴侣的抑制剂 ^6,7,8。Hsp70 是一种高度保守的蛋白质。出于这个原因，据报道，几种真核生物的 Hsp70，例如恶性疟原虫（疟疾的主要病原体）可替代大肠杆菌中的 DnaK 功能 ^6,9。通过这种方式，开发了一种基于大肠杆菌的互补测定法，涉及大肠杆菌中Hsp70s的异源表达，以探索其细....

研究方案

1. 转型

注意：使用无菌玻璃器皿进行培养、移液器吸头以及新鲜制备和高压灭菌的培养基。在2x酵母胰蛋白胨（YT）[1.6%胰蛋白胨（w / v），1%酵母提取物（w / v），0.5%NaCl（w / v），1.5%琼脂（w / v）]琼脂中制备 大肠杆菌 细胞的培养物。协议中使用的一般试剂及其来源在 材料表中提供。

1. 标记 2.0 mL 微量离心管并等分试样 50 μL 感受态大肠杆菌 dnaK756细胞，将细胞保持在冰上。
2. 将 10-50 ng pQE60/DnaK、pQE60/KPf 和 pQE60/KPf-V436F 质粒^{DNA 9} 等分装到具有感受态细胞的 2.0 mL 微量离心管中。
3. 将含有感受态细胞和质粒 DNA 的 2.0 mL 微量离心管在冰上保存 30 分钟。
4. 在42°C下将感受态细胞 - DNA混合物热休克60秒，并将微量离心管放回冰上10分钟。
5. 加入950μL新鲜的2x YT肉汤（在37°C下预孵育），并在37°C下孵育，同时以150转/分钟振荡1小时。如有必要，让细胞生长更长时间以促进其恢复。
   注意：避免剧烈摇晃细胞。
6. 移液 100 μL 细胞并将它们铺布到 2x YT 琼脂平板....

讨论

该方案证明了 大肠杆菌 dnaK756细胞在探索异源表达的 Hsp70 的伴侣功能方面的效用。该测定可用于筛选 纤维素中靶向 Hsp70 功能的抑制剂。然而，该方法的一个局限性是，在大 肠杆菌 中不能替代 DnaK 的 Hsp70 与该测定不兼容。一些非天然 Hsp70 缺乏翻译后修饰²¹ 可能是它们在 大肠杆菌 系统中缺乏功能的原因。基于酵母的互补测定²²可以?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	8,05,740	Constituent for sample loading dye
Acetic acid	Labchem	101005125	Constituent of destainer
Acrylamide	Sigma-Aldrich	8008300100	Component of SDS
Agar	Merck	HG000BX1.500	Constituent of medium and liquid growth assay
Agarose	Clever Scientific	14131031	Certified molecular biology agarose
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	101875295	Constituent for SDS-PAGE gel
Ampicillin	VWR International	0339—EU—25G	Selective antibiotic
Bis	Sigma-aldrich	1015460100	Component of SDS
Bromophenol	Sigma-Aldrich	0449-25G	Constituent for sample loading dye
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	For competent cells preparation
Coomassie brilliant blue	VWR International	443293X	SDS-PAGE dye
Dibasic sodium phosphate	Sigma-Aldrich	RB10368	Constituent of PBS buffer
ECL	Thermofischer Scientific	32109	Western blot detection reagent
Ethidium Bromide	Thermofischer Scientific	17898	DNA intercalating dye
Glycerol	Merck	SAAR2676520L	Constituent for sample loading dye
Glycine	VWR International	10119CU	Component of SDS
IPTG	Glentham life sciences	162IL	inducer
Kanamycin	Melford	K0126	Selective antibiotic
Magnesium Chloride	Merck	SAAR4123000EM	Constituent of medium and liquid growth assay
Methanol	Labchem	113140129	Constituent of destainer
Monobasic potassium phosphate	Merck	1,04,87,30,250	Constituent of PBS buffer
Peptone	Merck	HG000BX4.250	Constituent of medium and liquid growth assay
Potassium chloride	Merck	SAAR5042020EM	Constituent of PBS buffer
PVDF membrane	Thermofischer scientific	PB7320	Western blot membrane
Sodium Chloride	Merck	SAAR5822320EM	Constituent of medium and liquid growth assay
Sodium dodecyl sulphate	VWR International	108073	To resolve expressed proteins
Spectramax iD3	Separations	373705019	Automated plate reader
TEMED	VWR international	ACRO420580500	Component of SDS gel
Tetracycline	Duchefa Biochemies	T0150.0025	Selective antibiotic
Tris	VWR International	19A094101	Component of SDS gel
Tween20	Merck	SAAR3164500XF	Constituent for Western wash buffer
Western transfer chamber	Thermofisher Scientific	PB0112	Transfer of protein to nitrocellulose membrane
Yeast extract	Merck	HG000BX6.500	Constituent of medium and liquid growth assay
α-DnaK antibody	Inqaba	BK CAC09317	Primary antibody
α-rabbit antibody	Thermofischer scientific	31460	Secondary antibody