在体外溶栓模型中跟踪剪切流下钱德勒环形成的全血凝块的纤维蛋白溶解

摘要

体外 溶栓测定通常难以复制 体内 条件，无论是在正在消化的模型血栓中还是在发生溶栓的环境中。在此，我们探讨了如何将钱德勒环和实时荧光流动纤维蛋白溶解测定 （RT-FluFF） 偶联用于高保真、 离体、凝块溶解监测。

摘要

血栓栓塞和相关并发症是全球发病和死亡的主要原因，并且已经开发了各种测定法来测试溶栓药物 在体外 和 体内的效率。由于与动物模型相关的复杂性和成本，以及它们通常缺乏对人类生理学的可转化性，因此对用于药物开发的更具生理相关性的 体外 凝块模型的需求越来越大。流量、压力和剪切速率是循环系统的重要特征，在流动下形成的凝块与静态形成的凝块表现出不同的形态和消化特性。这些因素在传统的 体外 凝块消化测定中通常没有得到体现，这可能具有影响药物转化成功率的药理学意义。

Real-T ime Fluorometric Flowing Fibrinolysis （RT-FluFF） 测定被开发为一种高保真溶栓检测平台，它使用在剪切流下形成的荧光标记凝块，然后在存在或不存在纤溶药物制剂的情况下使用循环血浆进行消化。通过改变血栓形成和血栓消化步骤的流速，系统可以在高度多样化的实验设置中模拟动脉、肺部和静脉状况。可以使用在线荧光计连续进行测量，也可以通过获取离散时间点以及传统的终点凝块质量测量进行测量。RT-FluFF 检测是一种灵活的系统，允许在更准确地代表体内生理条件的流动条件下实时跟踪凝块消化，同时保持体外检测系统的控制和可重复性。

引言

从根本上说，由血栓栓塞病因引起的疾病是当今社会发病和死亡的主要来源。血栓栓塞发病机制的表现包括但不限于心肌梗死、缺血性卒中、深静脉血栓形成和肺栓塞¹。正在进行的大量研究，跨越多个学科，围绕着开发安全有效的方法来处理致病性血栓形成。血栓形成的动脉和静脉表现的差异以及不同的解剖位置导致了不同治疗方法的发展。然而，急性治疗通常依赖于通过纤溶酶原激活剂进行药物溶栓，在某些临床情况下有可能进行机械血栓切除术²。

新型药物治疗策略的开发从根本上依赖于体内动物模型和用于临床前测试的体外消化模型 ^3,4。体内模型自然受益于它们能够捕捉各种生理参数对治疗效果的复杂相互作用，包括药物的清除以及细胞与药物的相互作用。然而，这种相同的复杂性往往使此类模型相当昂贵，并且在试图分离与人类生理学显着不同的动物的潜在药效学/动力学时，会带来额外的问题。体外模型的发展有助于促进蒸馏测试环境，在该环境中可以进行药物开发和筛选，但通常缺乏概括所研究疾病状态所需的保真度。

通常发现的用于测试新型溶栓剂的体外方案依赖于利用在静态条件下形成和裂解的凝块，其中残留的凝块质量作为主要终点 ^5,6。不幸的是，这些技术无法解释凝块溶解的机械方面，例如湍流和经血栓压降，这些方面会显着改变测试药物的药效学。此外，在静态条件下形成的凝块包含与生理性凝块不同的微结构。血凝块形成过程中剪切力的存在已被证明会影响由此产生的血栓特性，例如血小板活化和纤维蛋白交联。在剪切流下产生的凝块从尖端到尾部表现出复杂的非均质性，这在静态形成的凝块^{中不存在7,8}。这种对生理凝块结构的偏离可能会影响重要的药物开发表征，包括药物在血栓内的渗透和随后的裂^解效率9。

为了解决与使用静态凝血/凝块溶解模型相关的一些限制，在存在剪切的情况下采用钱德勒环进行凝块形成和凝块溶解已经重新出现¹⁰.尽管与相对静态的测定相比，此类系统可以更好地表示流动动力学并产生具有更生理相关结构的凝块，但它们简化的流动条件仍然代表着与生理条件的偏差。最后，由于微流体方法易于成像和均匀的流动模式，也被采用;然而，它们仍然显着消除了主要受大多数临床相关血栓栓塞疾病影响的大血管内预期的生理条件^11,12。

考虑到上述讨论，我们开发了一种高保真度的 体外 溶栓模型，用于临床前溶栓药物筛选。该模型旨在解决上述新型溶栓疗法筛选领域的一些当前陷阱，并经过验证了在不同浓度的组织纤溶酶原激活剂 （tPA） 下的可重复性和敏感性。本文描述的系统利用蠕动泵、压力阻尼器、加热储液罐、两个压力传感器、在线荧光计和荧光标记的钱德勒环剪切形成凝块模拟物提供生理剪切流，以促进纤维蛋白溶解的实时跟踪¹³。总而言之，整个系统被称为 实时荧光流动纤维蛋白溶解测定 （RT-FluFF Assay）¹⁴ ，本文将讨论在这种高保真 体 外溶栓模型中成功设置和运行测定的复杂性。

研究方案

下面提到的所有方法均符合机构审查委员会 （IRB） 协议和机构人类研究伦理委员会。所有健康志愿者在献血前都提供了书面和知情同意书。值得注意的是，协议中引用的所有材料都可以在 材料表中找到。虽然在整个协议中讨论了人WB和血浆，但可以购买和替代研究动物血液和因子耗尽的血液制品的使用。

1. 全血采集

1. 使用标准放血技术从同意的健康志愿者那里收集静脉全血 （WB）。
   注意:确保在整个协议中遵循通用预防措施，以降低与血液或其他潜在传染性物质接触的风险。使用手套、实验室外套和面罩是必要的。
2. 将 ~50 mL WB 直接收集到 3.2% 柠檬酸钠管中，并立即混合到 50 mL 管中以供后续使用。
   注意:除了确保将血液收集到柠檬酸盐管中外，还需要丢弃管子以填充到制造商推荐的体积。新鲜收集的 WB 将最好地概括宿主的凝血动力学。WB在室温下（使用前≤4小时）短期储存是允许的。WB 不会储存过夜，因为当通过血栓弹力图检查时，这已被证明会影响凝血动力学¹⁵。

2. 血栓形成

1. 加入 3 mL 柠檬酸全血中，加入荧光（荧光素异硫氰酸酯 [FITC]） 标记的纤维蛋白原 （FITC-Fg） 至终浓度为 60 μg/mL（假设内源性血浆纤维蛋白原浓度为 3 mg/mL，则荧光标记的纤维蛋白原与未修饰的纤维蛋白原的比例为 1:50）。
   注意:该比例可以增加到高达 1:10，对凝块形态的影响最小。^13,14 荧光标记的纤维蛋白原可以通过纤维蛋白原与异硫氰酸荧光素 （FITC） 反应来购买或产生。纤维蛋白原混合应在运行开始前 ≤5 分钟进行。
   1. 如果纤维蛋白原先前已分装并冷冻，则检查解冻的 FITC-Fg，以确保聚合不会过早开始，从而使其无法使用（确保溶液中没有颗粒或纤维）。
2. 在37°C水浴中用直径为120mm的滚筒准备Chandler循环装置（图1）。确保钱德勒回路装置在整个凝块形成过程中能够以 0-90 rpm 的固定旋转率旋转。
   注意:其他 Chandler 循环设置和修改可以在 Zeng 等人中找到。¹⁶.
3. 切割管材（内径 5/32"，外径 7/32"）并形成牢固但不紧紧地围绕滚筒的环。对于此处讨论的推荐管尺寸，切开一个标准的 200 μL PCR 管，用作连接管两端以形成闭环的配件。
   注意:不同尺寸的管子可用于产生不同尺寸的凝块¹⁶。
4. 通过以 1:17 的比例向全血中加入 200 mM 氯化钙溶液来启动血液凝固。使用 3 mL 注射器将血液装入管路（填充管体积的 ~50%）。立即将环放在连接两端的钱德勒环形鼓上并开始旋转。
   1. 在装载前确保适当混合并轻轻倒置，以避免因 WB 组分沉降而引起的任何问题。
   2. 确保每次运行向每根管子中添加等量的血液，因为如果不一致，这会影响凝块大小。
   3. 由于血柱内的气泡也会影响血液凝固，因此请以类似"跷跷板"的方式轻轻移动管子以将其清除，以促进气泡逸出，然后再将它们装入滚筒中。
5. 以 40 RPM 的旋转速率旋转部分浸没在水浴中的滚筒，以实现计算出的剪切速率 ~450 ^s-1。
   注:有关基于管道尺寸和转速（20 至 60 RPM）¹⁶ 计算剪切力的信息，请参阅 Zeng 等人。典型的静脉剪切率和动脉剪切率分别为 20-200 ^s-1 和 300-1,000 ^s-1，其中 ~400-500 ^s-1 代表肺动脉。
6. 在弱光条件下让凝块形成 40-60 分钟，以尽量减少荧光标记的纤维蛋白原的光漂白。
7. 达到所需的凝血时间后，从管道中取出凝块并立即使用。为确保在不影响结构的情况下温和地去除凝块，请轻轻地倒置管子，让凝块慢慢从管子中滑出到一个小容器中。
   注意:将形成的凝块储存在柠檬酸盐血浆或PBS中，在4°C下过夜可能会影响流环中凝块消化的后续分析。

3. RT-FluFF仪器设置

1. 确保流量回路设备已连接，如图 2 所示，并且所有连接都牢固。简而言之，流量回路装置按流动方向的顺序包括:泵>阻尼器>入口压力传感器>凝块>出口压力传感器>荧光计>加热的储罐>泵。调整泵容量、实验流速、管道直径和长度、温度、储液罐体积和凝块尺寸/几何形状的选择，以适应每个研究独特的实验需求。
   注意:对于此示例，Chandler 回路中使用的相同直径的管道用于 RT-FluFF。该管道可以在同一天用于多次运行，但需要监测降解或泄漏，并根据需要进行更换/冲洗。建议在两次运行之间用温蒸馏水冲洗。根据实验设计，可能需要在每次运行后更换管道。
2. 固定所有管道后，打开压力监测器。检查入口和出口传感器的压力监测仪读数是否为 0 mmHg。如果没有，请打开阀门以确保压力传感器对大气压开放并将传感器归零。
3. 打开正在使用的加热块或水浴，并在实验过程中监测温度。保持温度接近 37 °C，以模仿人体生理温度。
4. 将泵打开到所需的流速以检查是否有泄漏，并验证压力传感器是否正常工作。
   注意:此管尺寸的流速为 ~160 mL/min 将代表剪切速率为 ~500 ^s-1。
5. 关闭泵以方便凝块加载。

4. 将凝块加载到流动回路中

1. 如果正在使用以前储存的凝块，请确保在将凝块加载到流环系统之前将凝块加热到室温。
2. 凝块质量损失是溶栓测定的重要终点测量。最佳做法是在将凝块质量加载到流回路之前测量凝块质量，而不是依赖先前的测量结果。
   1. 凝块质量测量每次都应始终以相同的方式进行，以确保样品之间和检测日的一致性，因为凝块内和凝块上的液体含量会显着影响其质量。最佳做法是在实验室湿巾上轻轻吸干凝块，直到它们不再向湿巾上释放大量液体，在整个测量过程中注意不要压缩凝块。
3. 将凝块浸没在血浆（自体或型匹配）或流环中使用的其他流动相溶液（如 PBS 或特定培养基）中，置于较浅的容器（如称量盘）中。流动相溶液应直接从 50 mL 系统储液槽中取出，以控制系统总体积。在凝块负荷阶段不应存在溶栓剂或药物检测剂。建议运行流环的流动相总体积为 ≥50 mL，并且所有样品的体积应保持一致。
4. 拆量环路管的中心部分（入口和出口传感器之间），并将 10 mL 注射器连接到管的一端。
5. 使用管路的自由端，将其置于等离子体（或流动相）中，并吸收少量溶液以灌注管路。然后将管道入口放在凝块附近，仔细检查凝块以识别凝块的头部（通常是凝块稍厚的一端）和尾部（与凝块相对的一端）。凝块的头部应朝向入口压力传感器，并远离出口。将管子放在凝块的"尾"端，然后用注射器将其吸入管子中。
   注意:在无法目视确定凝块头/尾部方向性的情况下，最好根据了解钱德勒环路的旋转方向来分配方向性 - 凝块头朝向滚筒旋转的相反方向。
6. 将管道连接回主设备，使凝块最靠近出口压力传感器（凝块的头部应背对出口传感器）。用两根 30 G 针以"X"形刺穿管子和凝块头，将凝块固定在其位置。在跑步期间将这些针头留在里面。
   注意: 根据阻尼器和泵设置，可能需要额外的针头以确保凝块不会过早破裂。如有必要，可以在凝块下游的管道中添加一个滤网，以防止凝块碎片在系统中循环。一旦确定了一定数量的针头来固定凝块，就要在各种条件下保持一致。
7. 取剩余的流动相溶液，将其放入50 mL管中作为储液槽。
8. 将储液罐放入水浴中，然后放入入口和出口管（出口来自荧光计，入口进入泵头）。
9. 检查正在使用的荧光计是否已连接并受到监控。在实验开始时，检查初始值与仅流动相系统基线相比是否合适。
   注意:如果没有在线荧光计，则可以在整个流环分析期间按规定的时间间隔对储液罐进行连续定期采样。在任何市售分光光度计完成实验后，可以立即使用 96 孔板读取收集的馏分。
10. 将 500 μL 的 100,000 ng/mL tPA 直接添加到储液槽体积中，以达到 50 mL 中最终 1,000 ng/mL tPA 浓度。添加的体积、浓度和特异性药物将取决于所需的目标循环浓度和系统储液库体积。
11. 在启动泵之前检查以下内容:
    1. 所有路口都是安全的。
    2. 压力传感器上方的两个阀门处于适当的关闭位置。
    3. 储液罐中的任何残留等离子体（或流体）均已被替换。
    4. 溶栓剂已加入储液罐中并适当混合。
    5. 进气管靠近储液罐的底部（这确保了最小的气泡）。
    6. 出口管是安全的，并且处于所需压力的适当高度（取决于正在建模的容器位置）。
    7. 泵旋转方向正确（流量顺序:泵>阻尼器>凝块>荧光计>储液罐>泵）。
    8. 如果泵的转速设置得非常高 （>150 rpm），请以较慢的速度启动并逐渐上升，以确保压力的快速变化不会使凝块破裂或导致管道泄漏。
    9. 确保系统正确记录来自荧光计的数据和/或准备好用于流动相定期采样的耗材，以便进行实验后时间点读取。
12. 打开泵并设置它以达到 160 mL/min 的所需体积流速，或增加流速直到达到所需的压力。系统将充满液体和气泡。气泡会人为地提高荧光读数，因此请注意气泡是否清除。一旦他们这样做，关掉灯并开始数据采集。
13. 让泵保持运行，直到凝块显着降解或所需的实验时间过去（≥60分钟）。在整个实验过程中，根据需要通过储液槽将试剂添加到系统中，以创建独特的实验条件，测试各种溶栓变化。
    注意:实验时间将取决于泵的流速（剪切水平）和溶栓剂的浓度。
14. 测定完成后，降低体积流速，并在泵仍在运行时取下入口管，以将系统中的大部分流体推入储液罐（一些流动相将保留在管中）。在管子的出口压力传感器侧断开含凝块的管路部分，并将其降低到称重舟中。
15. 取下将凝块固定到位的针头，以收集系统内的残留液体和凝块/凝块碎片。根据需要使用注射器帮助清理系统。
16. 称重并处理剩余的凝块以进行其他分析，例如计算质量损失百分比或用于组织学。

5. 清洁系统

1. 在样品之间，用温水以高转速 （>150 rpm） 冲洗整个系统。将水装入水箱并流过系统至少 2 分钟，排空，然后再次运行以进行两次完整的系统冲洗。冲洗后，如果荧光计读数没有恢复到基线值，请重复冲洗过程以进行额外的循环。如果仍未恢复到基线，则在测定下一个样品之前完全更换管路。
   注意:在实验过程中，管道可以在样品之间重复使用;但是，由于使用针头将凝块固定到位，因此每次运行后都应更换入口和出口压力传感器之间的管道部分。在某些实验条件下，可能需要在每次运行或聚类分析后更换整个管组，以消除任何样品交叉污染。
2. 在为当天的实验运行所有样品后，取出所有管子并丢弃。用热水和刷毛刷擦洗 T 形接头直至干净，然后晾干并用热水冲洗注射器阻尼器。使用 70% EtOH 来帮助无菌。

结果

钱德勒环凝块形成
在形成血栓时，我们通常以四重血栓为目标，以确保如果存在任何血凝块异常值（基于大体形态和质量），我们仍然有能力进行一式三份溶栓测定。假设最佳加载条件，凝块的长度 （~3.3 cm）、重量 （~100 mg） 和外观都应该相当均匀，如图 3 所示。在使用FITC-Fg时，我们还旨在在紫外光下检查凝块，以确保荧光相对均匀的色散，而不是凝块内?...

讨论

凝块形成和标记
钱德勒环已被证明提供了一种简单有效的方法，可以可重复生成模拟 体内 血栓¹⁶ 的凝块。通过微调管道尺寸、转速、转鼓直径和凝血时间等参数，可以在不同的剪切条件下快速生成凝块，从而捕获在模拟动脉和静脉源的血栓范围内所欣赏的结构特征。正如我们在 RT-FluFF 系统中所展示的那样，能够引入 FITC-Fg 等标记物的额外灵活性扩大了这?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G Disposable Hypodermic Needles	Exel International	26439	Other Consumables
6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long	uxcell	B07SXGSQ82	Chandler loop,
96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate	Corning	3635	Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile
Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes	Air-Tite	MLB3	RT-FluFF Apparatus , dampeners
Arium Mini Plus Ultrapure Water System	Sartorius	NA	DI water source
Calcium Chloride	Millipore Sigma	C5670	Other Consumables
Disposable BP Transducers	AD Instruments	MLT0670	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans HemoMed Pod	Drager	5588822	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans Patient Monitor	Drager	SC 7000	RT-FluFF Apparatus
Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)			Chandler loop,
Face Shield	Moxe	SHIELDS10	Chandler loop,
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate	Thermo Scientific	F13191	Other Consumables
Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile	Masterflex	30600-04	RT-FluFF Apparatus
Fluorescein (FITC)	Thermo Scientific	119245000	Other Consumables
General-Purpose Water Bath	Thermo Scientific	2839	Chandler loop,
Hotplate 4 × 4	Fisher Scientific	1152016H	RT-FluFF Apparatus
Human Source Plasma Fresh-Frozen	Zen-Bio	SER-SPL	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
Human Whole Blood	Zen-Bio	SER-WB-SDS	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor	Masterflex	77200-62	RT-FluFF Apparatus, Pump Head
L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC	Masterflex	7528-10	RT-FluFF Apparatus, Pump
Motor Speed Controller	CoCocina	ZK-MG	Chandler loop,
Nalgene Tubing T-Type Connectors	Thermo Scientific	6151-0312	RT-FluFF Apparatus
Peristaltic pump tubing	Masterflex	06424-15	Other Consumables
Phosphate buffered saline	Millipore Sigma	P3813	Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Switching Power Supply	SoulBay	UC03U	Chandler loop,
Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL	Thermo Scientific	S751010	Other Consumables
Tissue plasminogen activator, human	Millipore Sigma	T0831	Other Consumables
Tubing ID 1/4'', OD 3/8''	Fisher Scientific	AGL00017	Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors
Tubing ID 5/32", OD 7/32"	Tygon	ND-100-65, ADF 00009	Other Consumables
V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight	uvBeast	uvB-V3-365-MINI	Chandler loop, used to check completed clots
ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm	Pangyoo	ZGA37RG	Chandler loop,