破骨细胞与人诱导多能干细胞的分化和表征

摘要

该方案介绍了人破骨细胞与诱导多能干细胞（iPSCs）的分化，并描述了破骨细胞和破骨细胞前体的表征方法。

摘要

该方案详细介绍了人iPSC的繁殖和传代以及它们分化为破骨细胞。首先，将iPSC解离成单细胞悬浮液，以进一步用于胚状体诱导。在中胚层诱导后，胚状体发生造血分化，产生漂浮的造血细胞群。随后，收获的造血细胞经历巨噬细胞集落刺激因子成熟步骤，最后进行破骨细胞分化。破骨细胞分化后，破骨细胞的特征是结合甲基绿色核染色进行 TRAP 染色。破骨细胞被观察到为多核 TRAP+ 多核子。组织蛋白酶 K 染色可以进一步支持它们的鉴定。骨和矿物质吸收测定可以进行功能表征，确认真正的破骨细胞的身份。该协议展示了一种区分人破骨细胞和iPSCs的稳健且通用的方法，并允许在需要大量功能性人破骨细胞的应用中轻松采用。可以设想在骨骼研究、癌症研究、组织工程和内假体研究领域的应用。

引言

破骨细胞 （OC） 是造血来源^{的 1,2} 多功能细胞类型，通常被研究人员用于骨病研究 ^3,4、癌症研究 ^5,6、组织工程 ^7,8 和内假体研究 ^9,10 等领域.然而，OC 分化可能具有挑战性，因为单核前体融合成多核 OC 对于产生功能性 OC¹¹ 是必要的。一些生物学因素，如NF-κB配体受体激活剂（RANKL）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），是OC分化所必需的。据报道，M-CSF 对细胞增殖、细胞存活和 RANK 表达有积极影响 12,13,14。另一方面，RANKL 与 RANK 结合，后者激活诱导破骨细胞生成的下游信号级联反应。激活通过 TNF 受体相关因子 6 （TRAF6） 介导，这导致 B 细胞抑制剂 α （IκB-α） 中 κ 轻多肽基因增强子的核因子降解，α 是一种结合 NF-kB 二聚体的结合蛋白^16,17。因此，IκB-α降解释放NF-kB二聚体，然后转位到细胞核中并诱导转录因子c-Fos和活化T细胞核因子1（NFATc1）的表达。这反过来又触发了大量 OC 分化相关蛋白^{的转录 15,18}。上调蛋白（如 DC-Stamp 和 Atp6v0d2）介导 OC 前体的细胞间融合，导致合胞体形成 19,20,21。

就人原代细胞而言，CD34⁺ 和 CD14⁺ PBMC 是目前用于分化为 OCs²² 的最广泛使用的细胞类型。然而，这种方法受到来自供体²³ 的收获细胞 CD34⁺ 群体内的异质性及其有限的扩增性的限制。人 iPSC 是 OC 的替代来源。由于它们可以无限繁殖²⁴，因此它们允许 OC 生产的可扩展性和升级。这允许区分大量的OC，从而促进OC研究。

已经发表了几种将 iPSC 分化为 OC 的方案 25,26,27。整个分化过程可分为iPSC增殖部分、中胚层和造血分化部分以及OC分化。在分化过程之前繁殖 iPSC 允许在分化之前扩大 OC 产量。关于中胚层和造血分化存在几种方法。传统上，胚状体 （EB） 形成已被用于分化造血细胞，但基于单层的方法代表了另一种不需要 EB 诱导的造血分化策略。然而，基于单层的系统似乎需要进一步优化，因为我们和其他人发现基于EB的方法对于OC的区分更可靠。

在这里，我们描述了使用基于EB的方案将OC与人iPSCs区分开来。该方案改编自Rössler等人²⁶ ，并进行了修改以提高稳健性并允许在分化过程中进行冷冻保存。首先，我们在分化 10 天后仅收获一次造血细胞。然后对造血细胞进行冷冻保存，以便在分化过程中具有更大的灵活性。此外，我们将造血细胞接种密度从 1 x 10⁵ 增加到 2 x 10⁵ 个细胞/cm² 用于 OC 分化。使用较新的人 iPSC 无血清培养基（hiPSC-SFM，见 材料表），并用 200-300 μg/mL 的基础膜提取物（见 材料表）代替 0.1% 明胶进行孔包被。青霉素/链霉素未添加到培养基中。

Rössler等人²⁶的方案最初从iPSC改编为巨噬细胞分化方案²⁸，该方案使用EB形成进行造血分化。虽然研究人员已经将 EB 的形成用于造血分化很长一段时间^29,30，但文献中已经描述了几种 EB 诱导方法，例如自发聚集、圆底孔板离心、悬滴培养、生物反应器培养、锥形管培养、慢转侧血管和微模凝胶培养³¹.该方案使用在圆底孔板中离心解离的iPSC，使单个iPSC细胞彼此靠近并允许球体（EB）形成，如下所述。

研究方案

注意:本协议中使用的所有试剂都可以在 材料表中找到。除非另有说明，否则所有介质在使用前都预平衡至37°C。所有离心步骤均在37°C下进行，并使用最慢的加速/减速模式。除非另有说明，否则上清液始终使用一次性巴斯德玻璃移液器去除。

1. 人iPSCs的解冻和繁殖

1. 在解冻 iPSC 前一天，用浓度为 200-300 μg/mL 的 1 mL 基础膜提取物包覆 6 孔板的孔。将孔板置于4°C过夜。
2. 第二天，解冻并使用 P1000 移液器将细胞转移到 15 mL 管中。滴加 5-7 mL DMEM/F-12 和 15 mM HEPES。
3. 将细胞以300 ×g 离心5分钟。轻轻地从离心机中取出细胞，并确保不要干扰细胞沉淀。
4. 用巴斯德玻璃移液管小心地除去上清液，并使用宽口径吸头的P1000将细胞重悬于1mL hiPSC-血清游离培养基（含有10μMRho激酶（ROCK）抑制剂Y-27632的hiPSC-SFM）中。
5. 从前一天包被的孔中抽吸基底膜提取物（步骤1.1），并将1mL hiPSC-SFM和10μM Y-27632转移到孔中。向孔中加入重悬的 iPSC，以达到每孔 2 mL 的最终体积。
6. 旋转板以均匀分布iPSC聚集体，然后放入37°C和5%CO₂的培养箱中。
7. 使用hiPSC-SFM（不添加ROCK抑制剂Y-27632）每隔一天进行一次完全培养基更换。iPSCs通常在繁殖3-4天后达到70-80%的汇合度。

2. 传代iPSCs

1. 在传代 iPSC 前一天，用浓度为 200-300 μg/mL 的基础膜提取物包被 6 孔板的孔。将孔板置于4°C过夜。
   注意:确认细胞已达到大约 70-80% 的汇合度。确保 iPSC 不会过度融合（融合度超过 80%），因为这将促进自发分化。
2. 通过使用10μL或20μL移液器吸头或细胞刮刀在体视显微镜下去除分化区域或具有许多死亡iPSC聚集体的区域来开始传代iPSC。分化区域的颜色会显得更密集或更白。
   注意:刮掉的细胞聚集体可能仍部分附着在井底。
3. 用宽口径 P1000 移液管清洗井底数次，以去除可能仍部分附着在井底的任何聚集体。
4. 弃去培养含有分离的iPSC聚集体的培养基。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）再重复洗涤步骤两次。
5. 接下来，每孔加入 1 mL 5 U/mL 分散酶。iPSC菌落的边缘将从孔板上脱落，在室温下孵育3-5分钟后，可以在体视显微镜下观察到。
6. 小心地去除分散酶以避免轻微分离的聚集体脱落，并加入 1 mL DMEM/F-12 和 15 mM HEPES。使用一次性细胞升降机将聚集体切成小尺寸。使用干细胞传代工具可以提高iPSC聚集体大小的一致性。
7. 用孔中的培养基洗掉切片的iPSC聚集体，并使用5 mL血清移液管或具有宽孔吸头的P1000将培养基与聚集体转移至15 mL锥形管中。
8. 用 DMEM/F-12 冲洗孔，并将培养基转移到装有 iPSC 聚集体的 15 mL 管中。
9. 将切片的iPSC聚集体以200 ×g 离心3分钟。用巴斯德玻璃移液管取出上清液，加入 2 mL hiPSC-SFM 以去除并使用 5 mL 血清移液管或具有宽口径吸头的 P1000 重悬 iPSC。
10. 从预包被孔板中抽出剩余的基底膜提取物，并向 6 孔板的每个孔中加入 1 mL hiPSC-SFM。
11. 使用具有宽孔尖端的 P1000 将 iPSC 转移到 6 孔板的新孔中，使最终体积为每孔 2 mL hiPSC-SFM。根据iPSC细胞系的不同，需要优化分流比。在这里，使用了 1:6 的分流比。
12. 在立体显微镜下检查孔中的浮动骨料和骨料尺寸。理想情况下，聚集体尺寸应在 50-200 μm 之间。
13. 在聚集体转移后，旋转孔板以使细胞均匀分布在板上，并在37°C下以5%CO₂ 孵育至70-80%汇合。

3. 冷冻 iPSC

1. 要冷冻iPSC细胞，如上所述传代细胞（参见方案步骤"2.iPSCs的传代"）。将细胞切成菌落并洗掉孔底（步骤2.10）后，将切片的聚集体以200 ×g 旋转3分钟。吸出上清液。
2. 向 15 mL 试管中加入 1 mL 无血清冷冻保存培养基，并使用具有宽孔尖端的 P1000 重悬切片聚集体。
3. 将细胞转移到预先标记的冷冻管中。关闭试管并将试管转移到4°C的预冷冻存容器中。 将细胞储存在-80°C下24-48小时。
4. 将冷冻管转移到液氮中进行长期储存。
   注:OC分化过程的示意图如 图1所示。

4. 胚状体诱导

1. 如上所述培养和扩增足够的 iPSC 用于 EB 诱导。
   注意:可以通过增加胚状体的数量来扩大OC的产量，这反过来又会产生更高的造血细胞产量。一个 70-80% 汇合 iPSC 的孔在 6 孔板孔中每孔产生约 8.4 x 10⁵ 个细胞。需要 12,500 个单细胞 iPSC 才能形成一个胚状体。
2. 从 iPSC 培养物中抽吸用过的培养基，并用 D-PBS 冲洗 iPSC 菌落。
3. 向 6 孔板的每个孔中加入 0.5 mL 预热至室温的单细胞解离试剂，并旋转培养容器以覆盖整个孔表面。将培养容器在37°C孵育5-8分钟。
4. 从培养箱中取出容器，吸出单细胞解离试剂，并向孔中加入 1 mL 阶段 1 分化培养基，该培养基由含有 50 ng/mL 人骨形态发生蛋白 4 （hBMP4）、50 ng/mL 人血管内皮生长因子-165 （hVEGF）、20 ng/mL 人干细胞因子 （hSCF） 的 hiPSC-血清游离培养基组成， 和 10 μM Y-27632。
5. 用 Stage 1 培养基冲洗孔，轻轻分离细胞。将解离的 iPSC 汇集到 15 mL 锥形管中。
6. 向孔中加入 1 mL 第 1 阶段分化培养基，洗掉任何剩余的细胞，或对不易洗掉的菌落使用细胞刮刀。
7. 将所有细胞转移到试管中后，在室温下以200 ×g 离心5分钟以形成细胞沉淀。使用 5 mL 血清移液管或具有宽孔吸头的 P1000 将细胞吸入并重悬于总共 2 mL 预平衡的 1 阶段分化培养基中。
8. 使用血细胞计数器或自动细胞计数装置对细胞进行计数。将培养基加入含有单细胞悬浮液的 15 mL 试管中，在 100 μL 阶段 1 分化培养基中的圆底超低附着 96 孔板中每孔板 12,500 个细胞。
   注意:在显微镜下，细胞将显示为单细胞悬浮液，细胞分散在整个孔中。
9. 将96孔板以100 ×g离心3分钟。离心后，在显微镜下观察时，细胞应开始类似于球状体。将板置于37°C培养箱中24小时。
10. 在第 1 天和第 2 天用第 1 阶段分化培养基更换一半的培养基。为了提高效率，使用多通道移液器将 50 μL 用过的第 1 阶段分化培养基置入培养皿中。
11. 从96孔板中取出培养基后，在体视显微镜下检查可能被意外取出的EB。使用带有宽口径吸头的 P1000 移液器将意外移除的 EB 转移到 96 孔板中。
12. 使用多通道移液器向圆底超低附着 96 孔板的每个孔中加入 50 μL 新鲜的 Stage 1 分化培养基。

5. 造血分化

1. 在开始造血分化前一天，用浓度为 200-300 μg/mL 的 1 mL 基底膜提取物包覆 6 孔板的孔。将孔板置于4°C过夜。
   注意:在本协议的稍后时间点，每口井将接收 8 个 EB。根据制备的EB数量，相应地涂覆孔。
2. 用 3 mL 阶段 2 分化培养基吸出 6 孔板的过量基底膜提取物和预填充孔，该培养基由造血基础培养基组成，其中加入 2 mM 超谷氨酰胺、55 μM 2-巯基乙醇、25 ng/mL 人白细胞介素 3 （hIL-3） 和 100 ng/mL 人巨噬细胞集落刺激因子 （hM-CSF）。
3. 使用具有宽孔尖端的 P1000，将 8 个 EB 转移到 6 孔板的每个孔中。转移后，通过肉眼或在体视显微镜下确认每个孔中有 8 个 EB。
   注意:1 天后，浮动 EB 将粘附在井底。在接下来的 5-7 天内，包含造血细胞的漂浮细胞群应该变得可见。造血分化期可以变化，从 7 天开始。10 天的分化显示造血群体由大的 CD45⁺、CD14⁺ 和 CD11b⁺ 亚群组成。
4. 用第 2 阶段分化培养基处理 5 天后，通过取出用过的培养基并将其分配到 50 mL 锥形管中来进行培养基更换。缓慢移液以尝试去除尽可能少的浮动细胞，并保持尽可能低的剪切应力。在体视显微镜下移液有助于避免意外去除细胞。
5. 立即向孔中加入 1 mL 新鲜的 Stage 2 分化培养基。为了恢复在分化过程中此时可能已经存在的任何漂浮造血细胞，请勿丢弃分配的培养基。相反，用用过的培养基以300 ×g 旋转管5分钟，然后吸出上清液。
6. 将新鲜的第 2 阶段分化培养基添加到试管中并重悬，以分离可能已与用过的培养基转移的细胞。
7. 将 2 mL 新鲜的 Stage 2 分化培养基和回收的细胞加入到每个孔中，该孔先前填充了 1 mL Stage 2 分化培养基。
8. 在造血分化的第 10 天，检查是否存在大量漂浮的造血细胞。通过将它们收集在 50 mL 管中收获。它们可以在 10% DMSO、50% FBS 和 40% 培养基中冷冻，也可以立即用于将细胞分化为 OC。

6. M-CSF成熟和OC分化

1. 将浓度为 200,000 个细胞/cm² 的细胞接种到组织培养物处理的孔板上，并用补充有 10% FBS 和 50 ng/mL hM-CSF 的 α-MEM 处理。
2. 为了进行功能测定或成像，在接种后3天，使用具有宽孔尖端的P1000用预热的PBS洗涤至37°C，分离M-CSF成熟细胞。可能需要重复洗涤步骤才能完全分离细胞。
3. 使用具有宽孔尖端的P1000将分离的细胞转移到15mL管中，并以300 ×g 离心5分钟。弃去上清液。
4. 用OC分化培养基重悬并溶解细胞沉淀，该培养基由补充有10%FBS，50ng / mL hM-CSF和80ng / mLhRANKL的α-MEM组成。使用血细胞计数器或自动细胞计数装置对细胞进行计数，并以 200,00-250,000 个细胞/cm² 的密度将 M-CSF 成熟细胞重新接种在适当的培养皿中用于功能测定或成像（即骨吸收测定、用于成像的盖玻片载玻片等）。
5. 用OC分化培养基分化7-9天。每 2-3 天用新鲜的 OC 分化培养基进行一次完整的孔培养基更换。
   注意:多核 OC 通常在 5-7 天后出现。

结果

在整个分化过程中监测细胞形态
下面描述的所有结果均使用 MCND-TENS2 iPSC 系进行 OC 分化生成。该 iPSC 系之前已用于多项研究^32,33。尽管如此，其他iPSC细胞系也已成功用于该分化方案。

定期的视觉评估揭示了iPSCs在整个分化过程中与OCs的不同和不同的形态学特征（图2）。将iPSC菌落（

讨论

该协议提供了一种可靠且稳健的方法来将 iPSC 区分为 OC。然而，在整个差异化过程中可能会遇到一些陷阱。使用该协议³³ 成功分化了来自不同组织来源的细胞生成的人 iPSC 细胞系。冷冻iPSCs时（参见方案步骤"3.冷冻 iPSCs"），在传代点将一个孔冷冻回一个冷冻管中。解冻时（参见协议步骤"1.人iPSCs的解冻和繁殖"），将一个冷冻管解冻到6孔板的单个孔中。不同的iPSC细胞系会表现得?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-10ML
Antibody - Anti-Cathepsin K	Abcam	ab19027
Antibody - APC-conjugated Anti-Human CD45	BD	555485
Antibody - APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555751
Antibody - BV711-conjugated Anti-Human CD14	BD	563372
Antibody - BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype Control	BD	563125
Antibody - Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647	Abcam	ab150079
Antibody - PE-conjugated Anti-Human CD14	R&D Systems	FAB3832P-025
Antibody - PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11b	R&D Systems	FAB16991P-025
Antibody - PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34	BD	560710
Antibody - PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD	557872
Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11b	Biolegend	301308
Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl	Biolegend	400118
Antibody - PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD	550795
Antibody - PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43	BD	563521
Bone Resorption Assay Kit	CosmoBioUSA	CSR-BRA-24KIT
Countess 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher	16812556
Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Sytems	3434-010-02	Basal membrane extract
DAPI	R&D Systems	5748/10
Dispase (5 U/mL)	STEMCELL Technologies	7913
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES	Stem Cell	36254
DMSO	Sigma Aldrich	D2650
DPBS	Sigma Aldrich	D8537-500ML
Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4)	STEMCELL Technologies	78211
Human IL-3	STEMCELL Technologies	78146.1
Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF)	STEMCELL Technologies	78150.1
Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL)	STEMCELL Technologies	78214.1
Human Stem Cell Factor (hSCF)	STEMCELL Technologies	78155.1
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)	Biolegend	422301
Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165)	STEMCELL Technologies	78073
Invitrogen Rhodamine Phalloidin	Invitrogen	R415
MEM α, nucleosides, no phenol red	ThermoFisher	41061029
mFreSR	STEMCELL Technologies	05855	Serum free cryopreservation medium
mTeSR Plus medium	STEMCELL Technologies	100-0276	Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM)
Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate	Thermo Scientific	174925	Round bottom ultra-low attachment 96-well plate
P1000 Wide Bore Tips	ThermoFisher	2079GPK
ROCK-Inhibitor Y-27632	STEMCELL Technologies	72304
StemSpan SFEM	StemCell	09650	Hematopoietic cell culture medium
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red	Thermo Fisher	12563011	Single-cell dissociation reagent
Ultraglutamine	Bioscience Lonza	BE17-605E/U1
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium	Bioscience Lonza	04-418Q	Hematopoietic basal medium
µ-Slide 8 Well High	Ibidi	80806