评估大鼠膈肌运动单元连接结果测量作为膈运动神经元变性和代偿的定量生物标志物

摘要

在这项研究中，我们 提出了一种体内 方法，用于估计运动单位的数量和大小，以量化大鼠膈肌运动单位的连接性。描述了这些技术的分步方法。

摘要

通气肌功能丧失是运动神经元损伤和神经退行性变（例如，分别是颈脊髓损伤和肌萎缩侧索硬化症）的结果。膈运动神经元是中枢神经系统和肌肉之间的最终环节，它们各自的运动单位（由单个运动神经元支配的肌肉纤维组）代表神经肌肉通气系统的最小功能单位。复合肌肉动作电位 （CMAP）、单运动单位电位 （SMUP） 和运动单位数估计 （MUNE） 是已建立的电生理学方法，能够随着时间的推移对动物模型中的运动单位完整性进行纵向评估，但主要应用于肢体肌肉。因此，本研究的目的是描述临床前啮齿动物研究中的一种方法，该方法可以纵向用于量化膈 MUNE、运动单位大小（表示为 SMUP）和 CMAP，然后证明这些方法在运动神经元丢失模型中的实用性。运动神经元损伤和疾病中神经元损伤、变性和再生的敏感、客观和翻译相关的生物标志物可以显着帮助和加速实验研究发现到临床测试。

引言

膈运动神经元 （MN） 从 C3 到 C6 肌节水平延伸，形成从中枢神经系统 （CNS） 到横膈肌的最终连接¹。膈运动单位 （MU） 由单个脊髓 MN 及其神经支配的膈肌纤维组成，形成呼吸神经肌肉系统的最小功能单位。通气功能需要通过协调激活膈 MU 池来实现膈肌的充分收缩 ^2,3。许多神经系统疾病，包括肌萎缩侧索硬化症 （ALS），会导致严重的通气障碍，最终导致死亡⁴。

可以采用几种电生理学方法来评估和监测体内运动单位 （MU） 池的完整性。复合肌肉动作电位 （CMAP） 反映了周围神经刺激后特定肌肉或肌肉群中所有肌纤维的总和去极化，并且对一系列神经肌肉疾病敏感，包括 ALS ^5,6 和脊髓性肌萎缩症 （SMA）^7,8,9。CMAP 评估的一个局限性是，即使在存在 MU 丢失的情况....

研究方案

所有程序均按照密苏里大学机构动物护理和使用委员会制定的指导方针获得批准和执行。在 11 至 15 周龄的成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠身上进行了实验。这些大鼠成对饲养，并保持在 12：12 的明暗循环下，随时可以使用标准的商业颗粒食品和 HCl 处理过的水。

1. 动物准备和麻醉分娩

1. 处理老鼠时，应佩戴合适的个人防护装备。
2. 用 3-5% 异氟醚注射吸入麻醉剂，确保适当的诱导。一旦大鼠被充分麻醉，将其置于仰卧位，并用 1-3% 吸入异氟醚维持麻醉。使用镊子轻轻地对后肢脚垫施加压力，以确保没有撤退反应，以检查麻醉深度的充足性。
   注意：根据大鼠的大小和体重，监测麻醉深度，并相应地调整异氟醚浓度。
3. 使用恒温加热板将温度保持在 37 °C，以防止温度变化影响 CMAP 振幅和延迟。
4. 在眼睛上涂抹兽用石油基软膏以防止干燥。通过观察呼吸频率并检查用镊子对脚垫施加压力时的撤退反应来监测麻醉深度。
5. 去除胸部和颈部下三分之一的毛发，用剪刀进行研究。在整个实验过程中监测大鼠的呼吸。
   注意：在 CMAP 和 MUNE 记录并停止麻醉后，在大鼠恢复足够的意识之前，不要让大鼠无人看管。在动物完全康复之前，不要将动物送回家笼。

讨论

在 MN 退行性疾病（如 ALS）中，评估参与通气的 MU 至关重要²⁸。尽管 ALS 患者发生了呼吸性 MN 变性，但 MN 死亡的具体发生和进展仍不完全清楚 29,30,31。认识到这方面的重要性，各种模型，包括基于遗传的 （例如，SOD1 ^2,32） 和非基于遗传的 .......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Glass Syringe	Kent Scientific Corporation	SOMNO-2ML
50 mL, Model 705 RN syringe	Hamilton Company	7637-01	Utilized to conduct intrapleural injection
5008 - Formulab Diet	LabDiet	0001325
Autoclavable 26 G needles (26S RN 9.52 mm 40°)	Hamilton Company	7804-04	Utilized to conduct intrapleural injection
Cholera toxin B-subunit (CTB)	MilliporeSigma	C9903	Utilized for intrapleural injection to label surviving motor neurons
Cholera toxin B-subunit conjugated to saporin (CTB-SAP)	Advanced Targeting Systems	IT-14	Utilized for intrapleural injection to cause motor neuron death
Detachable Cable	Technomed	202845-0000	to connect the recorder electrode to the electrodiagnostic machine
Disposable 2" x 2" disc electrode with leads	Cadwell	302290-000	ground electrode
disposable monopolar needles 28 G	Technomed	202270-000	cathode and anode stimulating electrodes- recording electrodes
EMG needle cable (Amp/stim switch box)	Cadwell	190266-200	to connect monopolar electrodes to electrodiagnostic stimulator
Helping Hands alligator clip with iron base	Radio Shack	64-079	Maintaining recording electrode placement
Isoflurane (250 mL bottle)	Piramal Healthcare
monoject curved tip irrigating syringe	Covidien	81412012	utilized for application of electrode gel
PhysioSuite Physiological Monitoring System with RightTemp Homeothermic Warming	Kent Scientific Corporation	PS-RT	Includes infrared warming pad, rectal probe, and pad temperature probe
Pro trimmer Pet Grooming Kit	Oster	078577-010-003	clippers for hair removal
Saporin (SAP)	Advanced Targeting Systems	PR-01	Utilized for intrapleural injection (control agent when injected by itself)
Sierra Summit EMG system	Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA		portable electrodiagnostic system
SomnoSuite Low-Flow Digital Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	SOMNO	Includes anti-spill, anti-vapor bottle top adapter; Y adapter tubing; charcoal scavenging filter
Sprague-Dawley rat	Envigo colony 208a, Indianapolis, IN
Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment	Puralube	26870	applied during anesthesia to avoid corneal injury