用于单分子相关力和荧光显微镜的原位核小体组装

摘要

本文介绍了用于单分子相关力和荧光显微镜重建含核小体 DNA 系绳的详细实验程序。它进一步描述了几个下游实验，这些实验可以进行，以可视化染色质相互作用蛋白的结合行为并分析核小体物理性质的变化。

摘要

核小体构成真核染色质的主要单位，一直是许多关于其生物物理特性和与染色质结合蛋白相互作用的信息性单分子研究的重点。用于这些研究的 DNA 核小体重构通常涉及盐透析程序，该程序可精确控制沿 DNA 系绳形成的核小体的位置和数量。然而，该方案非常耗时，并且需要大量的 DNA 和组蛋白八聚体作为输入。为了提供一种替代策略，描述了一种利用组蛋白伴侣 Nap1 的单分子力和荧光显微镜的 原位 核小体重构方法。该方法使用户能够在任何 DNA 模板上组装核小体，而无需强大的核小体定位序列，按需调整核小体密度，并使用更少的试剂。 原位 核小体形成在几秒钟内发生，提供了更简单的实验工作流程，并方便地过渡到单分子测量。进一步描述了用于探测核小体机制和可视化单个蛋白质在染色质上的行为的两种下游分析的示例。

引言

真核染色质的主要包装单位是核小体，其中 ~147 个碱基对 （bps） 的 DNA 包裹在核心组蛋白的八聚体周围 ^1,2。除了基因组包装外，核小体结构还充当另一个丰富的生物物理调控层，染色质结合蛋白在执行其各种功能时可以利用该层 ^3,4。实验访问和测量核小体的物理特性在技术上具有挑战性，因为这些单元在微小的尺度（例如，纳米长度、皮微顿力）上执行，因此，它们的探测需要足够的灵敏度和精度才能有意义地告知功能。此外，染色质结合蛋白通常瞬时与其底物结合，并且大多数集成方法缺乏适当的时间分辨率来告知这些相互作用的动力学⁵。幸运的是，单分子技术的出现使得实时可视化和操纵单个蛋白质及其相互作用成为可能，揭示了有关在纳米尺度上发生的这些分子事件的机制信息⁶。特别是，单分子相关力和荧光显微镜 （smCFFM） 利用高分辨率荧光检测和力操作工具同时解析染色质和染色质-蛋白质复合物的力学、组成和配位 ^7,8。

研究方案

材料 表中列出了研究中使用的试剂和设备的详细信息。

1. 生物素化 DNA 的制备

1. 制备一个 120 μL 体积的反应，其中包含 20 μg λ DNA、33 μM 生物素-dCTP、33 μM 生物素-dUTP、33 μM 生物素-dATP、33 μM dGTP、10 单位 Klenow 酶和 1x NEB 缓冲液 2。
   注：该程序特别利用线性双链 （ds） 无甲基化噬菌体 λ 基因组 DNA （48,502 bps），其中包含 12 个核苷酸 （nt） 5' 单链 （ss） DNA 突出端²³。然而，该方案可以适应使用任何长度或序列的线性 dsDNA，前提是它包含至少几个 nt 的 ss 5' 突出端，长度和 nt 序列决定了安装在每端的生物素化 nts 的数量，用于光阱之间的下游连接。此外，反应可以按比例缩小。例如，在 30 μL 体积的反应中可以使用 5 μg DNA。此外，以这种方式产生的 DNA 底物不受扭转约束。有关创建扭转约束 DNA 的方案，请参阅之前发布的报告^24,25。
2. 在室温下孵育反应 15 分钟。
....

讨论

所描述的方案为核小体重构提供了几个优点，包括最大限度地减少试剂和时间，以及能够沿任何（可能是天然的）DNA 序列形成伴侣依赖性核小体。此外， 原位 方法允许更简单的实验工作流程，并方便地过渡到核小体力学和蛋白质-染色质相互作用的单分子测定。另一方面，这种方法的局限性包括无法沿 DNA 指导核小体定位（即使掺入了强大的核小体定位序列）和精.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x HR buffer	N/A	N/A	30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM magnesium acetate, 50 mM potassium chloride, 0.1 mg/mL BSA
1x PBS (Phosphate-buffered saline)	N/A	N/A	137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate dibasic, 1.8 mM potassium phophate monobasic
Acetic acid, glacial	Millipore Sigma	AX0074-6	Use to make tris acetate
Biotin-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATP	Jena Bioscience	NU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTP	Jena Bioscience	NU-956-BIO14-S
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9418-50G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye	Cytiva	PA23031	Maleimide functionalized Cy3 fluorophore
dGTP	New England Biolabs	N0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 R	Fisher Scientific	05-414-051	Benchtop centrifuge with cooling
Ethyl alcohol, Pure	Millipore Sigma	459844
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	E9884	Dissolve in H2O to 0.5 M
Human histone octamer (H4, L50C; H2A, K119C)	N/A	N/A	Recombinant histone proteins and those harboring labeling mutations were purified in-house as described previously (see refs. 33, 34, 35, 36). Briefly, recombinant histones were expressed in BL21 (De3) pLySS cells (Promega). Inclusion bodies were isolated after sonication, and histones were extracted under denaturing conditions. Histones were dialyzed into buffer A (7 M urea, 10 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, and 5 mM 2-mercaptoethanol), and the solution was added to a gravity column loaded with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). The flow through was then added to a gravity column loaded SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), and the histones were eluted from the column by adding buffer A supplemented with 600 mM sodium chloride. Histones harboring labeling mutations (H4, L50C; H2A, K119C) were purified and then conjugated to the desired fluorophore via maleimide-functionalized dyes (Cytiva, Lumidyne) using a 20:1 dye-to-protein molar ratio (see refs. 33, 34). Histone octamers were assembled by adding an equal molar ratio of each wild-type or fluorophore-labeled histone under denaturing conditions, dialyzed into a high-salt buffer containing 2 M sodium chloride, and then purified by size exclusion chromatography as described previously (see refs. 36, 37). Alternatively, individual histone proteins and ready-made histone octamers can be purchased commercially (e.g., Epicypher).
Image buffer	N/A	N/A	20 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride
Klenow Fragment (3' to 5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)	Thermo Fisher Scientific	SD0021	Methylation-free λ DNA
LD655-MAL	Lumidyne Technologies	9	Maleimide functionalized LD655 fluorophore
Linker histone H1.4 (A4C)	N/A	N/A	Purified recombinant protein made in-house (see ref. 38)
LUMICKS C-Trap Dymo	LUMICKS	N/A	Dual-trap configuration; standard materials for instrument provided by manufacturer
Magnesium acetate solution	Millipore Sigma	63052-100ML	Use to make HR buffer
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Included with Klenow Fragment kit
Pluronic F-127	Millipore Sigma	P2443-250G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Potassium chloride	Millipore Sigma	P3911	Use to make PBS and HR buffer
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662	Use to make PBS
S. cerevisiae Nap1	N/A	N/A	Nap1 was purified in-house as previously described (see refs. 33, 34). Alternatively, Nap1 can be purchased commercially (e.g., Active Motif).
Sodium acetate	Millipore Sigma	241245	Dissolve in H2O to 3 M
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888	Use to make PBS and image buffer
Sodium phosphate dibasic	Millipore Sigma	S9763	Use to make PBS
SPHERO Biotin Coated Particles (3.0-3.4 µm)	Spherotech	TP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Fisher Scientific	ND2000	NanoDrop Spectrophotometer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	Dissolve in H2O and adjust to appropriate pH; use to make image buffer and tris acetate