新生小鼠骨髓分离和骨髓来源巨噬细胞的制备

摘要

该方案描述了一种非酶和直接的方法，用于分离 7-9 日龄的新生小鼠骨髓细胞，并使用 L929 细胞的上清液作为粒细胞集落刺激因子 （M-CSF） 的来源来产生分化的巨噬细胞。进一步分析骨髓来源的巨噬细胞表面抗原 F4/80 、 CD206 、 CD11b 和功能能力。

摘要

从成年小鼠中分离骨髓的各种技术已经得到广泛确立。然而，从新生小鼠中分离骨髓具有挑战性且耗时，但对于某些模型来说，它在翻译上是相关和必要的。该方案描述了一种从 7-9 日龄幼崽制备骨髓细胞的有效且直接的方法。然后，这些细胞可以进一步分离或分化为感兴趣的特定细胞类型。巨噬细胞是重要的免疫细胞，在炎症和感染中起主要作用。在发育过程中，新生儿巨噬细胞对组织重塑有显著贡献。此外，新生儿巨噬细胞的表型和功能与成年巨噬细胞不同。该方案还概述了在 L929 条件培养基存在下新生儿巨噬细胞与分离骨髓细胞的分化。使用流式细胞术分析评估分化新生儿巨噬细胞的表面标志物。为了证明功能，还使用 pH 敏感染料偶联的大 肠杆菌测试了吞噬效率。

引言

骨髓包含造血干细胞群和间充质干细胞群，这些细胞群是自我更新的，可以分化成各种细胞谱系。骨髓中的造血干细胞产生骨髓和淋巴谱系¹。间充质干细胞产生成骨细胞（骨骼）、脂肪细胞（脂肪）或软骨细胞（软骨）²。这些细胞在细胞生物学和组织工程领域有多种应用，包括基因治疗 ^3,4。存在于骨髓中的祖细胞在谱系特异性生长因子存在的情况下分化成特定的细胞类型。促红细胞生成素促进红细胞祖细胞的增殖，粒细胞集落刺激因子 （G-CSF） 刺激中性粒细胞集落的生长，血小板生成素调节血小板的产生，这是谱系特异性生长因子的几个例子⁵。细胞表面抗原标记的 FACS 和磁激活细胞分选 （MACS） 是分离和纯化特定骨髓来源细胞类型的成熟方法⁶。

尽管新生儿研究正在朝着寻找新生儿死亡原因和解决早产并发症的方向发展，但直接治疗开发仍然是一个未得到满足的医疗需求。Smith 和 Davis 表示，“儿科患者仍然是治疗性孤儿”⁷。在新生儿临床研究中，获得同意存在一些挑战，例如样本小、结果的终生影响以及获得同意的伦理问题

研究方案

所有程序均由西弗吉尼亚州机构动物护理和使用委员会批准，并按照国家研究委员会的《实验动物护理和使用指南》的建议进行。本研究使用 C57BL/6J 小鼠幼崽。材料 表中列出了所有使用的试剂和设备的详细信息。

1. 培养基制备

1. 在 5 mL 离心管中制备 3 mL 补充有 10% FBS、2 mM 谷氨酰胺、25 mM HEPES 和青霉素 （100 U/mL）/链霉素 （100 μg/mL） 的 MEM 培养基，并保持在冰上。
2. 如果需要将骨髓祖细胞储存在液氮中，请准备含有 10% DMEM、80% FBS 和 10% DMSO 的冷冻培养基。
3. 对于完整的 DMEM，制备补充有 10% FBS、2 mM 谷氨酰胺、25 mM HEPES 和青霉素 （100 U/mL）/链霉素 （100 μg/mL） 的 DMEM。
4. 对于巨噬细胞分化，制备补充有 10% FBS、2 mM 谷氨酰胺、青霉素 （100 U/mL）/链霉素 （100 μg/mL） 和 10% L929 细胞上清液的 DMEM9,10,11。

讨论

涉及新生小鼠模型的研究可能会带来许多挑战。与成人相比，新生儿的免疫系统发育中是独一无二的⁸。因此，不应假设从成年动物模型生成的数据适用于新生儿，几篇已发表的著作已经很好地阐明了这一想法^18,19。因此，新生儿特异性模型和细胞来源对于研究早期免疫反应的复杂性是必要的。然而，由于新生小鼠的大小、敏感性和脆?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm strainer	Greiner	542040	Cell culture
96 well round (U) bottom plate	Thermo Scientific	12-565-65	Cell culture
Anti-mouse CD11b-BV786	BD Biosciences	740861	FACS analysis
Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488	BD Biosciences	141709	FACS analysis
Anti-mouse F4/80-PE	BD Biosciences	565410	FACS analysis
Countess3	Thermo Scientific	TSI-C3ACC	Automated cell counter
DMEM	Hyclone	SH30022.01	Cell culture
DMSO	VWR	WN182	Cell culture
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV	Cell culture
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775	Infection
EVOS FL	Invitrogen	12-563-649	Cell Imaging System
FBS	Avantor	76419-584	Cell culture
FluoroBright BMDM	Thermo fisher Scientific	A1896701	Dye free culture media
Glutamine	Cytiva	SH30034.01	Cell culture
HEPES	Cytiva	SH30237.01	Cell culture
L-929	ATCC		Differentiation
LSRFortessa	Becton Dickinson		Flowcytometer
Lysotracker red DND 99	Invitrogen	L7528	Fluorescent dye
MEM	Corning	15-010-CV	Cell culture
Penicillin /streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell culture
pHrodo green STP ester	Invitrogen	P35369	Fluorescent dye
T75 flask	Cell star	658170	Cell culture
Trypsin-EDTA	Gibco	25300120	Cell culture
Zeiss 710	Zeiss	P20GM103434	Confocal