在纳米和微米大小的囊泡中构建失衡代谢网络

摘要

我们提出了一种用于在亚微米和微米大小的脂质囊泡中重建膜蛋白并将酶和其他水溶性成分封装的方案。

摘要

我们提出了一种将复杂的蛋白质网络掺入囊泡的方法，该网络涉及整合的膜蛋白、酶和基于荧光的传感器，使用纯化的组分。该方法对于生物反应器的设计和构建以及复杂失衡代谢反应网络的研究具有重要意义。我们首先根据先前开发的方案将（多个）膜蛋白重构为大的单层囊泡 （LUV）。然后，我们通过冻融挤出封装纯化的酶、代谢物和基于荧光的传感器（荧光蛋白或染料）的混合物，并通过离心和/或尺寸排阻色谱法去除未掺入的组分。通过监测 ATP/ADP 比率、代谢物浓度、内部 pH 值或其他荧光读数参数，实时测量代谢网络的性能。我们直径为 100-400 nm 的含膜蛋白囊泡可以使用现有但优化的程序转化为巨单层囊泡 （GUV）。该方法能够将可溶性成分（酶、代谢物、传感器）包含在微米大小的囊泡中，从而将生物反应器的体积增加几个数量级。含有GUV的代谢网络被捕获在微流体装置中，通过光学显微镜进行分析。

引言

自下而上的合成生物学领域侧重于构建（最小）细胞 ^1,2 和用于生物技术 ^3,4 或生物医学目的的代谢生物反应器 ^5,6,7,8。合成细胞的构建提供了一个独特的平台，使研究人员能够在模仿天然环境的明确条件下研究（膜）蛋白质，从而能够发现蛋白质和^{反应网络的}涌现特性和隐藏的生化功能9。作为迈向自主功能合成细胞的中间步骤，开发的模块可以捕获活细胞的基本特征，例如代谢能量守恒、蛋白质和脂质合成以及体内平衡。这些模块不仅增强了我们对生命的理解，而且^在医学8和生物技术¹⁰领域也有潜在的应用。

跨膜蛋白几乎是任何代谢网络的核心，因为它们将分子运入或运出细胞、发出信号并对环境质量做出反应，并发挥许多生物合成作用。因此，在大多数情况下，合成细胞中代谢模....

研究方案

1. 一般准备

1. 化学药品
   1. 将脂质（粉末形式）在_{CHCl 3} 中溶解至 25 mg/mL，以制备预成型脂质体。
      注意：最好准备新鲜的脂质储备液，但储备溶液也可以在-20°C下储存数周。处理粉末形式的脂质比使用已溶于_{CHCl 3} 的脂质更准确。CHCl₃ 应使用玻璃移液管和/或注射器处理，并储存在玻璃容器中，因为_{CHCl 3} 会溶解塑料。
   2. 将小分子（核苷酸，氨基酸，荧光探针）溶解在50mM KPi（缓冲液A，参见 表1）中进行封装过程，并将pH调节至7.00±0.01。将 MgCl₂ 溶解在去离子水中，以避免形成磷酸镁沉淀物。
      注意：储备溶液可以在-20°C下储存数周，但DTT除外，DTT是在实验当天新鲜制备的。
   3. 将离子载体（例如，缬氨霉素，尼日利亚菌素）溶解在DMSO或EtOH中，储备浓度为100-500μM。 在-20°C下储存数周;避免蒸发。
      注意：DMSO不具有挥发性，因此优于EtOH。使用玻璃代替塑料小瓶，以避免离子载体粘附在小瓶表面。
2. 缓冲区
   1. 在实验当天准备新鲜的缓冲液（表1）。不要储存超过 24 小时。
3. 可溶性蛋白的纯....

讨论

我们提出了一种方案，用于合成含有亚微米大小脂质囊泡（proteoLUVs）的（膜）蛋白，并将proteoLUVs转化为巨型单层囊泡（proteoGUVs）。该方案应适用于其他膜蛋白^13,19,30,40的重建和除此处介绍的L-精氨酸分解和甘油3-磷酸合成途径以外的代谢网络的包封。

脂质体中膜蛋白的重建通常?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma Aldrich	A9414-25g
Amicon cut-off filter	Sigma Aldrich	Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra
BioBeads	BioRad	152-3920
CHCl3	Macron Fine Chemicals	MFCD00000826
D(+)-Glucose	Formedium	-
D(+)-Sucrose	Formedium	-
DDM	Glycon	D97002 -C
Diethyl Ether	Biosolve	52805
DMSO	Sigma-Aldrich	276855-100ml
DOPC	Avanti	850375P-1g
DOPE	Avanti	850725P-1g
DOPG	Avanti	840475P-1g
DTT	Formedium	DTT005
EtOH	J.T.Baker Avantor	MFCD00003568
Extruder	Avestin Inc	LF-1
Fluorimeter	Jasco	Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol	BOOM	51171608
Gravity flow column	Bio-Rad	732-1010
Hamilton syringe 100 µL	Hamilton	7656-01
Hamilton syringe 1000 µL	Hamilton	81320
Handheld LCP dispenser	Art Robbins Instruments	620-411-00
Handheld Sonicator	Hielscher Ultrasound Technology	UP50H
HCl	BOOM	x76021889.1000
Imidazole	Roth	X998.4-250g
K2HPO4	Supelco	1.05099.1000
KCl	BOOM	76028270.1
KH2PO4	Supelco	1.04873.1000
Kimwipe	Kimtech Science	7552
Large Falcon tube centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810 R
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A5006-100G
Light microscope	Leica	DM LS2
L-Ornithine	Roth	T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope	Zeiss	LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670-1KG
Microfluidic chip	Homemade	PDMS based	DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP	Sigma-Aldrich	A2754-1G
NaCl	Supelco	1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer	Isogen Life Science	ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH	Supelco	1.06498.1000
Needles for GUVs	Henke-Ject	14-14575	27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics	Henke-Ject	14-15538	18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose	Cytiva	17526802
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143-5MG
Nutator	VWR	83007-210
Osmolality meter	Gonotec Salmenkipp	Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner	Plasma Etch	PE-Avenger
Polycarbonate filter	Cytiva Whatman	Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104	0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube	Beckman Coulter	355647
Pyranine	Acros Organics	H1529-1G
Quartz cuvette (black)	Hellma Analytics	108B-10-40
Sephadex G-75 resin	GE Healthcare	17-0050-01
Sonicator	Sonics Sonics & Materials INC	Sonics vibra cell
Syringe filter	Sarstedt	Filtropur S plus 0.2	0.2 µm
Syringe pump	Harvard Apparatus	A-42467
Tabletop centrifuge	Eppendorf	centrifuge 5418
Teflon spacer	Homemade	Teflon based	45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris	PanReac AppliChem	A1086.1000
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-100 ml
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima Max-E
UV lamp	Spectroline	ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer	Jasco	V730 spectrophotometer
Valinomycin	Sigma-Aldrich	V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope	Zeiss	AxioObserver
β-Casein	Sigma Aldrich	C5890-500g