胚胎小鼠脑切片中迁移神经元和神经胶质祖细胞的延时成像

摘要

在大脑皮层的发育过程中，神经元和神经胶质细胞起源于脑室内壁的心室区，并向大脑表面迁移。这个过程涉及许多基因。该协议介绍了迁移神经元和神经胶质祖细胞的延时成像技术。

摘要

在大脑皮层的发育过程中，神经元和神经胶质细胞起源于脑室内壁的心室区，并向大脑表面迁移。这个过程对于正常的大脑功能至关重要，其失调会导致出生后出现神经发育和精神疾病。事实上，已经发现许多导致这些疾病的基因参与了这一过程，因此，揭示这些突变如何影响细胞动力学对于了解这些疾病的发病机制非常重要。该协议引入了一种对从小鼠胚胎获得的脑切片中迁移的神经元和神经胶质祖细胞进行延时成像的技术。使用 宫内 电穿孔用荧光蛋白标记细胞，该电穿孔以高信噪比可视化从心室区迁移的单个细胞。此外，这种 体内基因 转移系统使我们能够通过共电穿孔给定基因的表达或敲低/敲除载体，轻松地对给定基因进行功能获得或功能丧失实验。使用该协议，可以分析单个细胞的迁移行为和迁移速度，这些信息从未从固定大脑中获得。

引言

在大脑皮层的发育过程中，侧脑室内衬的肺源脑室区 （VZ） 的（顶端）桡状胶质细胞首先产生神经元，然后产生神经胶质祖细胞，并有一些重叠的周期¹。神经元也来自与 VZ 相邻的脑室下区 （SVZ） 的中间祖细胞或基底放射状胶质细胞，两者都起源于（顶端）放射状胶质细胞 ^2,3。在小鼠中，放射状神经胶质细胞仅在胚胎日 （E） 12-14 产生神经元，在 E15-16 上产生神经元和神经胶质祖细胞，从 E17 开始产生神经胶质祖细胞⁴。在这些胚胎阶段产生的神经胶质祖细胞的主要群体优先分化为星形胶质细胞，尽管有些细胞也分化为少突胶质细胞⁵。在这些阶段产生的神经元和星形胶质细胞祖细胞向大脑表面迁移并进入皮质板（未来的皮质灰质）。神经元从 VZ 到皮质板的迁移分多个阶段进行。神经元首先在多极细胞积累区 （MAZ） 上方采用多极形态，与 SVZ 或中间区重叠，在那里它们大力伸展和缩回多个薄突并缓慢迁移（多极迁移）^6,7。大约 24 小时后，神经元转变为双极形态，向脑表面延伸一个厚的引导过程和一个向后延伸的薄拖突，并使用从放射状胶质细胞延伸到软脑膜表面的放射状过程作为支架向大脑表....

研究方案

本研究是在发育研究所、爱知发育障碍中心 （#2019-013） 和庆应义塾大学 （A2021-030） 动物护理和使用委员会的批准并遵循其指导方针进行的。定时怀孕 ICR（野生型）小鼠是市售的（参见 材料表）。为了观察迁移细胞与血管之间的关系，使用了 Flt1-DsRed 小鼠，其中内皮细胞表达 DsRed²²。雄性 Flt1-DsRed 小鼠与雌性 ICR 小鼠杂交 （两只小鼠都在 8-24 周龄）。所有动物均在无特定病原体 （SPF） 条件下饲养和操作，直至取样。本研究中使用的试剂和设备列在 材料表中。

1. 宫内 电穿孔

1. 通过将等体积的高压灭菌水添加到市售的 2x HBS 中来制备 HEPES 缓冲盐水 （HBS） 溶液。
2. 麻醉剂有两种选择;异氟醚 （吸入） 和 MMB （注射）。在使用 MMB 的情况下，请按如下方式准备。在 19.75 mL 高压灭菌水中加入 0.75 mL 美托咪定 （1 mg/mL）、2 mL 咪达唑仑 （5 mg/mL） 和 2.5 mL 布托啡诺 （5 mg/mL）²³。
   注意：这种麻醉溶液在 2 个月内变得不那么活跃。用遮光罩在 4 °C 下储存。
3. 准备阿替美唑溶....

讨论

该协议引入了一种对源自 pallial（皮层）VZ 的细胞进行延时观察的方法。为了标记来自 VZ 的迁移细胞，我们使用 了子宫 电穿孔，其中单个细胞被清楚地标记为比病毒载体介导的标记更高的信噪比。使用 宫内 电穿孔，可以很容易地将任何组合的任何类型的载体引入活胚胎的放射状神经胶质细胞（神经干细胞）。神经元和神经胶质祖细胞可以使用不同的启动子选择性标记。由于 子?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
Atipamezole (5 mg/mL)	Meiji	Mepatia
Autoclip	Becton Dickinson	427630	9 mm
B27 supplement	Gibco	17504-044
Butorphanol (5 mg/mL)	Meiji	Vetorphale
Cell culture insert	Millipore	PICM ORG 50
Confocal microscope	Nikon	A1RHD25	Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC)
Cryomold	Tissue-Tek	4566
Culture chamber	Tokken	TK-NBCMP	Custom-made
Electroporator	NEPA Gene	NEPA21
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Gas mixer	Tokken	TK-MIGM01-02
Glass base dish	Iwaki	3910-035	Diameter of glass base is 27 mm
Glass capillaries	Narishige	GD-1
HBS (2x)	Sigma-Aldrich	51558
HBSS(-)	Wako	084-08345
Heater Unit	Tokken	TK-0003HU20	Custom-made, including hood and heater
hGFAP-Cre	Addgene	#40591	A gift from Albee Messing
ImageJ			https://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 mM)	Gibco	25030
Low melting temperature agarose	Lonza	50100
Medetomidine (1 mg/mL)	Meiji	Medetomin
Microinjector	Narishige	IM-300
Midazolam (5 mg/mL)	Sandoz	Midazolam
MTrackJ			https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
pCAG-hyPBase			The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki).
pDcx-Dre			The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272).
Penicillin + Streptomycin	Gibco	15140122
Plasmid purification kit	Invitrogen	PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFP			CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute).
pPB-CAG-rDIO-EGFP			The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction  were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File.
Puller	Narishige	PN-31
StackRed		a plugin for ImageJ	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Suture needle	Nazme	C-24-521-R No.1	1/2 circle, length 14 mm
Suture thread	Nazme	C-23-B2	Silk, size 5-0
Timed pregnant ICR (wild-type) mice	Japan SLC	ICR mouse
TrackMate			https://imagej.net/plugins/trackmate/index
Tweezer-type electrode	BEX or NEPA Gene	CUY650P5
Tα1-EGFP			EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller)
Vibrating microtome	Leica or Zeiss	Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50.