胚胎小鼠脑切片中迁移神经元和神经胶质祖细胞的延时成像

摘要

在大脑皮层的发育过程中，神经元和神经胶质细胞起源于脑室内壁的心室区，并向大脑表面迁移。这个过程涉及许多基因。该协议介绍了迁移神经元和神经胶质祖细胞的延时成像技术。

摘要

在大脑皮层的发育过程中，神经元和神经胶质细胞起源于脑室内壁的心室区，并向大脑表面迁移。这个过程对于正常的大脑功能至关重要，其失调会导致出生后出现神经发育和精神疾病。事实上，已经发现许多导致这些疾病的基因参与了这一过程，因此，揭示这些突变如何影响细胞动力学对于了解这些疾病的发病机制非常重要。该协议引入了一种对从小鼠胚胎获得的脑切片中迁移的神经元和神经胶质祖细胞进行延时成像的技术。使用 宫内 电穿孔用荧光蛋白标记细胞，该电穿孔以高信噪比可视化从心室区迁移的单个细胞。此外，这种 体内基因 转移系统使我们能够通过共电穿孔给定基因的表达或敲低/敲除载体，轻松地对给定基因进行功能获得或功能丧失实验。使用该协议，可以分析单个细胞的迁移行为和迁移速度，这些信息从未从固定大脑中获得。

引言

在大脑皮层的发育过程中，侧脑室内衬的肺源脑室区 （VZ） 的（顶端）桡状胶质细胞首先产生神经元，然后产生神经胶质祖细胞，并有一些重叠的周期¹。神经元也来自与 VZ 相邻的脑室下区 （SVZ） 的中间祖细胞或基底放射状胶质细胞，两者都起源于（顶端）放射状胶质细胞 ^2,3。在小鼠中，放射状神经胶质细胞仅在胚胎日 （E） 12-14 产生神经元，在 E15-16 上产生神经元和神经胶质祖细胞，从 E17 开始产生神经胶质祖细胞⁴。在这些胚胎阶段产生的神经胶质祖细胞的主要群体优先分化为星形胶质细胞，尽管有些细胞也分化为少突胶质细胞⁵。在这些阶段产生的神经元和星形胶质细胞祖细胞向大脑表面迁移并进入皮质板（未来的皮质灰质）。神经元从 VZ 到皮质板的迁移分多个阶段进行。神经元首先在多极细胞积累区 （MAZ） 上方采用多极形态，与 SVZ 或中间区重叠，在那里它们大力伸展和缩回多个薄突并缓慢迁移（多极迁移）^6,7。大约 24 小时后，神经元转变为双极形态，向脑表面延伸一个厚的引导过程和一个向后延伸的薄拖突，并使用从放射状胶质细胞延伸到软脑膜表面的放射状过程作为支架向大脑表面线性迁移，这称为运动模式 ^2,8.因为处于运动模式的神经元总是到达皮质板的最外表面，穿过边缘区下方的前身，所以神经元在皮质板中以依赖于出生日期的由内而外的方式排列 ^9,10,11。

相比之下，星形胶质细胞祖细胞迅速迁移到中间区和皮质板，方向频繁改变。这种迁移行为与神经元迁移完全不同，称为不稳定迁移⁵ （erratric migration）。星形胶质细胞祖细胞也沿血管迁移，这个过程称为血管引导迁移。星形胶质细胞祖细胞在这些迁移模式之间切换并到达皮质板 ^5,12。虽然星形胶质细胞的位置并不严格由其产生日期决定，但已经观察到早产星形胶质细胞在皮质板浅表部分沉淀的轻微趋势⁵。有趣的是，定居在皮质板中的星形胶质细胞是在胚胎阶段产生的，最终分化为原生质星形胶质细胞，而出生后产生的星形胶质细胞不会主动迁移，而是留在白质中，并分化为纤维状星形胶质细胞⁵。星形胶质细胞亚型的这种阶段依赖性特征是如何发生的尚不清楚。

已经鉴定出越来越多的参与神经元迁移的基因，包括那些与神经发育和精神疾病有关的基因^13,14。因此，阐明这些基因突变对迁移神经元行为的影响至关重要。如前所述，神经元迁移发生在多个阶段。延时观察可以直接确定主要受影响的阶段（细胞周期退出、多极-双极转变、运动迁移速度等）。然而，星形胶质细胞的规格、迁移和定位的分子机制在很大程度上仍然未知。鉴于星形胶质细胞在大脑发育过程中的突触发生¹⁵ 和血脑屏障形成¹⁶ 中起着至关重要的作用，星形胶质细胞的发育缺陷可能导致神经发育障碍。对星形胶质细胞祖细胞的延时研究可能会阐明这些分子机制及其与精神疾病的关系。

该协议提供了一种对皮质 VZ 衍生细胞进行延时观察的方法。用于观察神经元迁移的类似视频方案已经发布¹⁷。在这里，我们描述了迁移神经元和星形胶质细胞祖细胞的方法。为了用荧光蛋白标记这些细胞，例如绿色和红色荧光蛋白（GFP 和 RFP），通过在适当的阶段通过宫内电穿孔将含有适当成分的质粒混合物引入皮质 VZ 18,19,20,21。在所需阶段取出纵的胚胎，并使用激光扫描显微镜将大脑切片并用于延时观察。使用这种方法可以检查迁移速度、方向和其他行为，这些行为从未使用固定大脑样本解决。在子宫内使用电穿孔、表达和敲低/敲除载体可以很容易地与荧光蛋白载体一起转移，使我们能够对特定基因进行功能获得和功能丧失研究。

研究方案

本研究是在发育研究所、爱知发育障碍中心 （#2019-013） 和庆应义塾大学 （A2021-030） 动物护理和使用委员会的批准并遵循其指导方针进行的。定时怀孕 ICR（野生型）小鼠是市售的（参见 材料表）。为了观察迁移细胞与血管之间的关系，使用了 Flt1-DsRed 小鼠，其中内皮细胞表达 DsRed²²。雄性 Flt1-DsRed 小鼠与雌性 ICR 小鼠杂交 （两只小鼠都在 8-24 周龄）。所有动物均在无特定病原体 （SPF） 条件下饲养和操作，直至取样。本研究中使用的试剂和设备列在 材料表中。

1. 宫内 电穿孔

1. 通过将等体积的高压灭菌水添加到市售的 2x HBS 中来制备 HEPES 缓冲盐水 （HBS） 溶液。
2. 麻醉剂有两种选择;异氟醚 （吸入） 和 MMB （注射）。在使用 MMB 的情况下，请按如下方式准备。在 19.75 mL 高压灭菌水中加入 0.75 mL 美托咪定 （1 mg/mL）、2 mL 咪达唑仑 （5 mg/mL） 和 2.5 mL 布托啡诺 （5 mg/mL）²³。
   注意：这种麻醉溶液在 2 个月内变得不那么活跃。用遮光罩在 4 °C 下储存。
3. 准备阿替美唑溶液。用 24.25 mL 高压灭菌水稀释 0.75 mL 阿替唑 （5 mg/mL）。
4. 在高压灭菌水中制备 0.2% （w/v） 固绿溶液。用过滤器（孔径 0.22 μm）消毒。
5. 根据制造商的说明，使用基于碱裂解和柱纯化²³ 的常规质粒纯化试剂盒制备质粒（参见 材料表）。将 100 mL 细菌培养物中纯化的质粒溶解在 30-50 μL HBS 中，以制备质粒原液 （3-5 μg/μL）（补充文件 1）。
   1. 用 HBS 混合并稀释质粒原液，并加入 1/10 体积的 0.2% 固绿以使注射剂着色。质粒的组分和最终浓度根据其用途确定（表 1）。
6. 通过使用移液器拉拔器拉动玻璃毛细管来制作微量移液器。
   注意：使用细镊子倾斜切割移液器的尖端。尖端的外径约为 70 μm。吸取 2 μL 水，以 2 μL 的间隔标记微量移液器。
7. 在适当阶段（遵循机构批准的方案），以 10 μL/g 体重的剂量腹膜内注射 MMB 麻醉剂到怀孕的小鼠中。
   注意：要操作的胚胎阶段应根据目的确定。为了标记未来的 II/III 锥体神经元，E14.5 是合适的。为了标记神经胶质祖细胞，必须在 E15-16 上进行电穿孔。或者，可以通过吸入异氟醚 （1%-2%） 来麻醉小鼠。
8. 小鼠深度麻醉后，将其放在 38 °C 的温板上。
   注意：确保鼠标对捏住尾巴没有反应。
9. 使用脱毛膏去除手术部位周围的毛皮后，用含碘的磨砂膏和 70% 的酒精以圆周运动对手术区域进行数次消毒。从^第 2 个最后对的水平向前沿中线做一个 2 厘米长的皮肤切口，然后沿着白线在腹壁上做一个 2 厘米的中线切口（图 1A）。
   注意：在腹壁切开的过程中，用细镊子轻轻抬起，以免割伤内脏。
10. 将一张无菌塑料片放在皮肤上，并在其上放置一张无菌纸巾（图 1A）。在中心挖一个孔，露出手术区域。
    注意：无菌塑料片和无菌纸巾在切开后放置，因为需要宽视野来定位切口，参考的位置。
11. 用无菌 PBS 润湿纸，仔细观察切口处的子宫角，并通过塑料片和纸的孔抽出子宫角。
12. 使用连接到抽吸管组件的微量移液器，通过呼气压力将 1 μL 质粒混合物通过子宫壁注入左心室或右心室（图 1A）。
    注意：或者，可以使用显微注射器注射质粒。
13. 用镊子型电极捏住胚胎的头部，并使用电穿孔仪施加电子脉冲（E14-16 为 35 V，E17 为 50 V，50 ms 方脉冲，间隔为 450 ms，5 次）（图 1A）。
    注意：不要用力捏胚头，否则会损坏胚胎。实际电流应为 40-70 mA。
14. 将子宫角放回腹腔。
15. 使用 5-0 丝线缝合腹壁。
16. 腹膜内应用剂量为 10 μL/g 体重的阿替美唑溶液。
17. 使用 5-0 丝线缝合皮肤。
    注意：可以使用自动剪辑来关闭皮肤。
18. 将操作过的小鼠放在温暖的板上至少 30 分钟。老鼠将开始在笼子里移动。
    注意： 宫内 电穿孔程序（从步骤 1.7 到 1.16）应在 30 分钟内完成。典型的操作时间为 20 分钟。

2. 切片的制备

注意：切片的新鲜度是本实验成功的关键。切片必须在 2 小时内准备好（来自步骤 2.5-2.12）。

1. 用 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 制备 Hanks 平衡盐溶液;HBSS（+） 的 URL。将 5 mL CaCl₂（14 g/L，高压灭菌）和 5 mL MgSO 4.7H₂O（20 g/L，高压灭菌）添加到 500 mL HBSS（-） 中。储存在 4 °C。 使用前，将溶液用 95% O₂ + 5% CO₂ 气体在冰上泡 5 分钟。
2. 准备培养基。至少需要 2.5 mL/皿。将 2 mL 胎牛血清、25 μL L-谷氨酰胺 （200 mM）、200 μL B27 （50x）、50 μL 青霉素 + 链霉素（10 K 单位/mL 和 10 mg/mL）添加到 8 mL Neurobasal 培养基中。
3. 制备 3% 低熔点琼脂糖凝胶。孔 50 mL HBSS（+），然后加入 1.5 mg 低熔点琼脂糖，高压灭菌。在微波炉中熔化琼脂糖，并在使用前将其保存在 50 °C 的水浴培养箱中。
4. 将 1.9 mL 培养基添加到玻璃基皿中。小心地将细胞培养插件放在上面，以免将空气球困在过滤器下方，然后在过滤器上添加 500 μL 培养基（图 1B）。将其放在冰上。
5. 通过吸入 5% 异氟醚麻醉操作小鼠后，在适当阶段通过颈椎脱位（遵循机构批准的方案）处死它们以进行观察。
   注意：在 E14.5 电穿孔后 2 天 （48 h） 和 3 天分别适合观察多极-双极过渡和运动模式。
6. 取出胚胎，将它们放入装有冷 PBS 的培养皿中。
7. 通过在显微镜下表达 GFP 或其他荧光蛋白来选择胚胎。
8. 胚胎斩首后，在解剖显微镜下解剖出大脑⁶ 并将它们保存在冷的 HBSS （+） 中。
9. 将熔化的 3% 低熔点琼脂糖凝胶倒入低温模具中（参见 材料表），然后将大脑放入其中并滚动数次。将其置于室温下，直到琼脂糖完全凝固，然后将其置于冰上。
10. 使用振动切片机以 350 μm 的厚度将大脑冠状切片（参见 材料表）。
11. 在过滤器上排列切片（每个过滤器最多 6 个切片）。
12. 从滤杯的内侧和外侧取出培养基（总共 600 μL）。在此步骤中，切片被压制并固定在过滤器上。5 分钟后，向细胞培养小室内部添加 100 μL 培养基。

3. 延时成像

1. 在成像前至少30分钟，使用腔室的加热器或封闭显微镜的罩子，将安装在倒置激光扫描显微镜载物台上的培养室保持在37°C，以防止Z漂移。向培养室供应加湿的 5% CO₂ + 40% O₂ 气体。
2. 将装有上面制备的切片的培养皿放在培养室中。
3. 使用长工作距离 20 倍镜头 （NA = 0.45），每 15-30 分钟以 5 μm 的步长采集大约 10 个 Z 堆栈图像，持续 24 小时。
   注意：强烈建议使用电动 XY 载物台。这使我们能够从多个物场获得图像。通常，我们在一次延时实验中从不同的物场获得 10-20 张图像。

4. 影像学分析

1. 使用 ImageJ 或其他软件通过 Z 轴的最大投影将 XYZT 图像转换为 XYT。
   注意：如果在观察过程中切片滑动，请使用 ImageJ 插件 StackRed 调整图像中单元格的位置，该插件具有刚体转换功能（请参阅 材料表）。
2. 手动或自动追踪 GFP 或其他荧光蛋白阳性细胞的轨迹。可以分别使用 MTrackJ²⁴ 和 TrackMate^25,26（ImageJ 插件）执行手动和自动描摹。使用 TrackMate 进行自动跟踪可以有效地以无偏差的方式分析许多细胞。但是，使用 MTrackJ 进行手动跟踪对于准确跟踪单个单元格仍然很有用。

结果

肺病 VZ 中的放射状神经胶质细胞只产生 E14 之前的神经元，以及 E15 和 E16 的神经元和神经胶质细胞。为了同时观察神经元和神经胶质细胞的迁移行为，我们使用神经元特异性启动子 Tα1 启动子²⁷ 和人神经胶质纤维酸性蛋白 （hGFAP） 启动子²⁸ 分别用增强的 GFP （EGFP） 和 RFP 标记它们，它在星形胶质细胞中优先激活。星形胶质细胞祖细胞在迁移过程中重复?...

讨论

该协议引入了一种对源自 pallial（皮层）VZ 的细胞进行延时观察的方法。为了标记来自 VZ 的迁移细胞，我们使用 了子宫 电穿孔，其中单个细胞被清楚地标记为比病毒载体介导的标记更高的信噪比。使用 宫内 电穿孔，可以很容易地将任何组合的任何类型的载体引入活胚胎的放射状神经胶质细胞（神经干细胞）。神经元和神经胶质祖细胞可以使用不同的启动子选择性标记。由于 子?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
Atipamezole (5 mg/mL)	Meiji	Mepatia
Autoclip	Becton Dickinson	427630	9 mm
B27 supplement	Gibco	17504-044
Butorphanol (5 mg/mL)	Meiji	Vetorphale
Cell culture insert	Millipore	PICM ORG 50
Confocal microscope	Nikon	A1RHD25	Equipped with a long working distance lens (S Plan Fluor ELWD 20XC)
Cryomold	Tissue-Tek	4566
Culture chamber	Tokken	TK-NBCMP	Custom-made
Electroporator	NEPA Gene	NEPA21
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Gas mixer	Tokken	TK-MIGM01-02
Glass base dish	Iwaki	3910-035	Diameter of glass base is 27 mm
Glass capillaries	Narishige	GD-1
HBS (2x)	Sigma-Aldrich	51558
HBSS(-)	Wako	084-08345
Heater Unit	Tokken	TK-0003HU20	Custom-made, including hood and heater
hGFAP-Cre	Addgene	#40591	A gift from Albee Messing
ImageJ			https://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 mM)	Gibco	25030
Low melting temperature agarose	Lonza	50100
Medetomidine (1 mg/mL)	Meiji	Medetomin
Microinjector	Narishige	IM-300
Midazolam (5 mg/mL)	Sandoz	Midazolam
MTrackJ			https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
pCAG-hyPBase			The hyPBase cDNA from pCMV-hyPBase (a gift from Sanger Institute) was inserted into the downstream of the CAG promoter of pCAGGS (a gift from J. Miyazaki).
pDcx-Dre			The Dcx promoter from Dcx4kbEGFP70 (a gift from Q. Lu) was exchanged with CAG promoter of pCAG-NLS-HA-Dre34 (a gift from Pawel Pelczar, Addgene #51272).
Penicillin + Streptomycin	Gibco	15140122
Plasmid purification kit	Invitrogen	PureLink HiPure plasmid midiprep kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFP			CAG-LNL cassette from pCALNL-DsRed (a gift from Connie Cepko, Addgene #13769), and TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute).
pPB-CAG-rDIO-EGFP			The sequence containning synthetic rox sites, synthetic DIO cassette, and EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in reverse direction  were inserted into the cloning site of pPB-CAG.EBNXN (a gift from Sanger Institute). The sequence is provided in the Supplementary File.
Puller	Narishige	PN-31
StackRed		a plugin for ImageJ	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Suture needle	Nazme	C-24-521-R No.1	1/2 circle, length 14 mm
Suture thread	Nazme	C-23-B2	Silk, size 5-0
Timed pregnant ICR (wild-type) mice	Japan SLC	ICR mouse
TrackMate			https://imagej.net/plugins/trackmate/index
Tweezer-type electrode	BEX or NEPA Gene	CUY650P5
Tα1-EGFP			EGFP cDNA from pEGFP-N1 (Clontech, U55762) was inserted into the downstream of the Tα1 promoter in plasmid 253 (a gift from P. Barker and F.D.Miller)
Vibrating microtome	Leica or Zeiss	Vibrating blade microtome VT1000S or Hyrax V50.