自闭症谱系障碍果 蝇 模型的行为评估范式

摘要

自闭症谱系障碍 （ASD） 与社交和交际行为受损以及重复行为的出现有关。为了研究 果蝇 模型中 ASD 基因与行为缺陷之间的相互关系，本文描述了五种行为范式，用于分析社交间距、攻击性、求偶、梳理和习惯化行为。

摘要

自闭症谱系障碍 （ASD） 包括一组异质性的神经发育障碍，具有常见的行为症状，包括社交互动和沟通能力缺陷、受限或重复行为增强，以及在某些情况下学习障碍和运动缺陷。 果蝇 已成为模拟大量人类疾病的无与伦比的模式生物。由于许多基因与 ASD 有关，果蝇已成为一种强大而有效的方法来测试推测与该疾病有关的基因。由于数百个具有不同功能作用的基因与 ASD 有关，因此 ASD 的单一遗传果蝇模型是不可行的;相反，ASD 相关基因的果蝇同源物的个体遗传突变体、基因敲低或基于过表达的研究是深入了解这些基因产物背后的分子途径的常用方法。 果蝇 中有许多行为技术可用，可以轻松读取特定行为成分的缺陷。果蝇的社会空间测定和攻击性和求偶测定已被证明可用于评估社交互动或交流的缺陷。苍蝇的梳理行为是重复行为的极好读数。习惯化测定用于果蝇以估计习惯化学习的能力，发现一些 ASD 患者会受到影响。这些行为范式的组合可用于对果蝇的人类 ASD 样疾病状态进行全面评估。使用 Fmr1 突变果蝇，概括人类的脆性 X 综合征，以及果蝇神经元中的 POGZ 同源 物行 敲除，我们显示了社交间距、攻击性、求偶行为、梳理行为和习惯化方面的可量化缺陷。这些行为范式在这里以最简单和直接的形式进行演示，并假设这将促进它们广泛用于 ASD 和果蝇模型中其他神经发育障碍的研究。

引言

自闭症谱系障碍 （ASD） 包括一组异质性的神经系统疾病。它包括一系列复杂的神经发育障碍，其特征是社交沟通和社会互动中的多情境和持续缺陷，以及存在受限、重复的行为和活动模式和兴趣¹。根据世界卫生组织 （WHO） 的数据，全球每 100 名儿童中就有 1 名被诊断出患有 ASD，男女比例为 4.2²。这种疾病在出生后的第二年或第三年变得明显。ASD 儿童表现出对社会情感互惠、非语言交流和人际关系技能缺乏兴趣。他们表现出重复的行为，如刻板的运动、僵化和仪式化的例行公事，以及对受限兴趣的强烈关注。房间隔缺损儿童对触觉、嗅觉、声音和味觉表现出高度的反应，而疼痛和温度反应相对较低¹。这种疾病的外显率在患有 ASD 的不同患者中也不同，因此变异性增加。

目前 ASD 的临床诊断基于个体的行为评估，因为没有涵盖所有形式的 ASD³ 的基于生物标志物的确认性或常见的基因测试。破译遗传和神经生理学基础将有助于靶向治疗策略。在过去的十年中，大量的研究导致鉴定出数百个基因在 ASD 患者中被删除或突变，或者其表达水平发生改变。正在进行的研究强调使用小鼠或果蝇等模式生物来验证这些候选基因的贡献，其中，这些基因被敲除或敲低，然后测试 ASD 样行为缺陷并阐明导致异常的潜在遗传和分子途径。概括人类染色体基因座 16....

研究方案

有关本协议中使用的所有材料和试剂的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 攻击性试验

1. 准备攻击性试验领域
   1. 取一个标准的 24 孔板（图 1A），并将板的每个孔用作苍蝇攻击的单个“竞技场”（图 1B）。在每个井中装满普通苍蝇食物的一半，并使其干燥过夜。
      注意：或者，竞技场中可能包括一个攻击性的焦点，例如一点酵母糊或被斩首的雌性，以确保雄性攻击性。
   2. 取任何透明的塑料/亚克力板，足以覆盖大约三到四个孔的表面。在片材上穿孔，形成直径为 ~2.5 mm 的小孔，以便通过它将单个果蝇插入孔中。
2. 准备苍蝇吸气器
   1. 取一根 30-50 厘米长的橡胶/硅胶管（图 1C1）。
   2. 取 200 μL（或 1,000 μL）移液器吸头，从窄吸头切下 ~1 cm。将切割端插入橡胶管的一端;这个尖端将是“嘴端”，用于基于嘴的抽吸。
   3. 取另一个移液器吸头，切开该吸头的窄端，形成一个足以让苍蝇通过它的开口。将此移液器吸头的底部插入试管的尾端;这将是吸气器的“飞端”，飞蝇将从这里被吸出（

讨论

果蝇 被用作人类神经系统疾病研究的精细模式生物，因为果蝇和人类疾病基因之间的基因序列高度保守⁹。许多稳健的行为范式使其成为研究在概括人类疾病的突变体中表现出的表型的有吸引力的模型。由于数百个基因与自闭症谱系障碍 （ASD） 有关，因此任何模式生物中都不存在常见的 ASD 模型。因此，对于每个突变体，研究人员必须首先在果蝇中建立 ASD 样表型。在本?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aggression arena:
Standard 24-well plate made of transparent polystyrene			12 cm x 8 cm x 2 cm. Diameter of a single well= 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; depth = 1 cm
Transparent plastic/acrylic sheet			Alternative: a perforated lid of a cell culture plate
Social Space Assay:
Binder clips			19 mm
Glass sheets and acrylic sheets of customized sizes			Thickness = 5 mm
Courtship assay:
Nut and bolt with threading
Perspex sheets of customized shapes			i) Lid: A custom-made round transparent Perspex disk (2-3 mm thickness, 70 mm diameter) with one loading hole at the peripheral region and another screw hole at the center (diameter ~ 3 mm for each); ii) A second transparent thicker Perspex disk (3-4 mm thickness, 70 mm diameter), with 6-8 perforations of diameter 15 mm, equidistant from the center; iii) Base: Same as lid except without the loading hole
Grooming assay:
Diffused glass-covered LED panel			10–15-Watt ceiling mountable LED panel
Habituation and Y-maze assay
Climbing chambers			x2, Borosilicate glass
Adapter for connecting Y-maze with entry vial			Perspex, custom made, measurements in Figure 5A
Clear reagent bottles			Borosil #1500017
Gas washing stopper			Borosil #1761021
Glass vial			OD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Odorant (Ethyl Butyrate)			Merck #E15701
Paraffin wax (liquid) light			SRL #18211
Roller clamps			Polymed #14098
Silicone tubes			OD = 0.6 cm, ID = 0.3 cm; roller clamps for flow control
Vacuum pump			Hana #HN-648 (Any aquarium pump with flow direction reversed manually)
Y-maze			Borosilicate glass
Y-shaped glass tube (borosilicate glass)			Custom made, measurements in Figure 5A
Common items:
Any software for video playback (eg.- VLC media player)			https://www.videolan.org/vlc/
Computer for video data analysis
Fly bottles			OD= 60 mm x Height= 140 mm; glass/polypropylene
Fly vials			OD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Graph-pad Prism software			https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/
ImageJ software			https://imagej.net/downloads
Timer
Video camera with video recording set up			Camcorder or a mobile phone camera will work
For Fly Aspirator:
Cotton			Absorbent, autoclaved
Parafilm			Sigma-aldrich #P7793
Pipette tips			200 µL or 1000 µL, choose depeding on outer diameter of the silicone tube
Silicone/rubber tube			length= 30-50 cm. The tube should be odorless
Composition of Fly food:
Ingredients (amount for 1 L of food)
Agar (8 g)			SRL # 19661 (CAS : 9002-18-0)
Cornflour (80 g)			Organic, locally procured
D-Glucose (20 g)			SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)
Propionic acid (4 g)			SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)
Sucrose (40 g)			SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)
Tego (Methyl para hydroxy benzoate) (1.25 g)			SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)
Yeast Powder (10 g)			HIMEDIA # RM027
Fly lines used in the experiments in this study:
Wild type (Canton S or CS)			BDSC # 64349
w1118			BDSC # 3605
w[1118]; Fmr1[Δ50M]/TM6B, Tb[+]			BDSC # 6930
w[*]; Fmr1[Δ113M]/TM6B, Tb[1]			BDSC # 67403
MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India)			BDSC # 50742
LN1-GAL4			NP1227, NP consortium, Japan
row-shRNA			BDSC # 25971