轻度创伤性脑损伤小鼠模型中血脑屏障破坏的评价

摘要

开发了一种方法，通过在不同的时间点向小鼠施用两种荧光染料来可视化由于血脑屏障 （BBB） 分解而导致的染料外渗。使用甘油作为冷冻保护剂有助于对同一样品进行免疫组织化学。

摘要

荧光染料用于确定由于血脑屏障 （BBB） 破坏而发生的染料外渗程度。使用这些染料进行标记是一个复杂的过程，受多种因素影响，例如血液中染料的浓度、脑血管的通透性、染料外渗的持续时间以及由于降解和扩散而导致的组织中染料浓度降低。在轻度创伤性脑损伤模型中，暴露于爆炸诱导的冲击波 （BSW） 会在有限的时间窗口内触发 BBB 崩溃。为了确定 BBB 分解的精确顺序，在相对于 BSW 暴露的不同时间点，将伊文思蓝和异硫氰酸荧光素-葡聚糖在血管内和心内注射到小鼠体内。然后记录染料荧光在脑切片中的分布。两种染料之间分布和强度的差异揭示了 BBB 分解的时空序列。脑切片的免疫染色显示星形胶质细胞和小胶质细胞反应与 BBB 分解部位相关。该协议在涉及不同 BBB 击穿模型的研究中具有广泛的应用潜力。

引言

血脑屏障 （BBB） 崩溃和功能障碍是由全身炎症、感染、自身免疫性疾病、损伤和神经退行性疾病引起的¹。在因暴露于爆炸诱导冲击波 （BSW） 而导致的轻度创伤性脑损伤 （mTBI） 中，已观察到 BSW 的强度与 BBB 击穿引起的荧光染料泄漏量之间存在显着相关性 ^2,3,4。mTBI 中 BBB 分解的一个显着特征是它立即开始或在暴露于 BSW 后几个小时内开始，并且通常是一个短暂的过程，持续约一周，然后延迟出现慢性神经系统疾病 3,5,6,7。尽管细节尚不清楚，但 BBB 分解是长期病理级联反应的一部分，也可能作为 mTBI⁶ 的预后因素。因此，了解大脑中 BBB 崩溃的空间和时间分布很重要。

荧光染料用于确定 BBB 分解的程度 ^3,8。由于染料的血液浓度以及 BBB 分解的大小和程度会随着时间的推移而变化，因此在解释染料外渗的图像时需要谨慎。例如，没有染料外渗并不一定表示没有 BBB 分解。在染料血液浓度增加之前或之后，可能无法检测到 BBB 分解。即使染料在发生 BBB 击穿的地方成功积累，也可能在击穿停止后随着时间的推移而丢失。一般来说，水溶性和生物惰性物质会迅速从尿液中排出⁹。因此，为了确定 BBB 分解是否发生在特定时间，在固定动物之前将荧光染料短时间注入血液中时，可以获得最可靠的结果。应以这种方式使用市售的具有特定分子量的异硫氰酸荧光素 （FITC）-葡聚糖。

伊文思蓝是一种广为人知的蓝色偶氮染料，对血清白蛋白具有很强的亲和力。该染料在生物系统中被绿光激发时发出红色荧光²。由于其惰性，伊文思蓝血清白蛋白复合物在血液中保留长达 2 小时，使其成为一种有用的 69 kDa 示踪剂，可用于标记 BBB 受损的区域至少在此持续时间内^10,11。因此，重要的是要考虑围绕伊文思蓝⁹ 的药代动力学和毒性的潜在不确定性。然而，最近的一项研究表明，埃文思蓝继续在 BBB 不存在或中断的区域积累⁷。此功能使 Evans Blue 能够记录 BBB 击穿的历史，而 FITC-葡聚糖用于记录 BSW 暴露后特定时间点的 BBB 击穿。虽然 Evans blue 可以静脉内或腹膜内给药¹⁰，但对于时间敏感的实验，静脉内给药是首选。本研究旨在证明使用 Evans blue 和 FITC-葡聚糖检测暴露于 BSW 后 BBB 崩溃的时空分布。

其次，该研究提出了一种在观察 BBB 分解的荧光并制备适用于免疫组织化学程序的更薄切片后冷冻脑切片的技术。使用甘油作为封固剂和冷冻保护剂简化了免疫组织化学过程。通过将 BBB 分解的图像与免疫组织化学的图像进行比较，BBB 分解的时空分布可以与同一样品的组织反应相关联。

研究方案

所有实验均按照国防医学大学（日本所泽）制定的动物实验伦理准则进行。该研究方案已获得国防医学院动物研究委员会的批准（批准号 23011-1）。本研究使用 8 周龄、体重 19-23 g 的雄性 C57BL/6J 小鼠。如图 1 所示，与单次 BSW 暴露相关的不同时间点进行单次伊文思蓝注射和 FITC-葡聚糖灌注。所用试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 麻醉

注意:这是一个修改后的方案，与原来的方案相比，美托咪定的量增加了 2.5 倍¹²。盐酸美托咪定、咪达唑仑和布托啡诺的剂量分别为 0.75 mg/kg、4 mg/kg 和 5 mg/kg。

1. 在生理盐水中制备盐酸美托咪定 （75 μg/mL）、咪达唑仑 （400 μg/mL） 和布托啡诺 （500 μg/mL） 的混合物。
2. 腹膜内施用混合物以麻醉小鼠 （10 μL/g）¹³。
3. 大约 5-10 分钟后，通过观察没有尾巴捏和踏板撤退反射来验证麻醉是否充分。
4. 让鼠标保持温暖，直到它从麻醉的影响中恢复过来。

2. BSW 暴露

注意:本研究中使用了内部休克管¹⁴。

1. 按照步骤 1 中的说明麻醉鼠标。
2. 将鼠标放置在距离电击管出口端 5 cm 的位置，确保其本体轴线平行但不与电击管的轴线对齐。
3. 向头部提供峰值超压为 25 kPa 的单次 BSW 暴露。
   注意:让鼠标保持温暖，直到它从麻醉作用中恢复过来。定期监测治疗小鼠的状况。如果观察到痛苦的迹象，例如进食或饮水困难、驼背或长时间没有恢复迹象的异常外观，请对小鼠实施安乐死并提前终止实验。避免使用镇痛药，因为它们可能会影响神经胶质反应。

3. 埃文思蓝注射到尾静脉

注意:伊文思蓝溶液应在无麻醉的情况下静脉内给药。在麻醉的情况下，染料通常不能充分渗透到体内，这可能是由于血压和体温降低¹³。伊文思蓝的给药剂量为 100 mg/kg。

1. 在微管中准备伊文思蓝溶液（4% w/v 盐水溶液），然后在使用前涡旋并避光储存。
2. 将溶液注入尾静脉 （2.5 μL/g）¹³。

4. 使用 FITC-葡聚糖溶液进行经心灌注和固定

1. 将肝素添加到磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中以获得 1 U/mL 的浓度，然后将 FITC-葡聚糖添加到肝素化的 PBS 中以达到 3 mg/mL 的浓度。
2. 使用前将 FITC-葡聚糖粉末完全溶解。为此，请轻轻摇动溶液 30 分钟或更长时间。使用前，请仔细检查是否有任何未溶解的 FITC-葡聚糖粉末。如果有残留，请继续摇晃直至完全溶解。
3. 按照步骤 1 中的说明麻醉鼠标。
4. 使用蠕动泵^15,16 继续执行标准灌注固定方案。首先，以 4.0 mL/min 的速率用含有 FITC-葡聚糖的肝素化 PBS 灌注 2 分钟。然后，以 4.0 mL/min 的速率灌注 10% 福尔马林中性缓冲溶液或 4% 多聚甲醛-PBS 2 分钟，然后以 3.5 mL/min 的速率灌注 8 分钟。
5. 使用手术剪刀和镊子小心地去除大脑^15,16。解剖后，在 4 °C 的相同固定剂（即，10% 福尔马林中性缓冲溶液或 4% 多聚甲醛-PBS）中将脑后固定过夜。
6. 第二天，用 PBS 替换固定剂。

5. 脑组织加工

注:即使灌注固定完成，伊文思蓝和 FITC-葡聚糖也可能分散到缓冲液中。因此，导致步骤 6.8 的程序应在灌注固定后一周内完成。此外，避免将样品暴露在光线下。

1. 制备一个 24 孔板，每个孔中加入 500 μL 20% 甘油的磷酸盐缓冲液 （PB;pH 7.4）。
2. 使用脑切片机，将大脑冠状面切成 12 片，每片 1 毫米厚。
3. 将每个切片转移到 24 孔板的相应孔中，并在 4 °C 下储存至少 2 小时。
4. 用 50% 甘油-PB 替换溶液，并在 4 °C 下储存至少 2 小时。
5. 最后，用 100% 甘油替换溶液。为了立即进行显微镜观察，让切片在室温下静置至少 2 小时或将它们储存在 4 °C 下。 切片现在将是半透明的，可以进行显微镜观察。

6. 染料外渗的荧光测量

注:荧光标记效率因小鼠而异。因此，荧光强度需要归一化。荧光值相对于巨细胞网状核 （GRN） 内的荧光值表示，因为该区域受 BSW 处理的影响最小。

1. 将 500 μL 甘油添加到 35 mm 玻璃底培养皿的底部。
2. 将切片转移到甘油溶液中，并用盖玻片覆盖其表面。
3. 从盖玻片边缘去除多余的甘油。
4. 在荧光显微镜下测量切片的荧光强度。
5. 显微镜测量后，将切片放回孔中。
6. 对所有 12 个切片重复测量。
7. 向每个孔中加入 500 μL PB，并将 24 孔板在 4 °C 下储存过夜;第二天，切片将用 50% 甘油-PB 饱和。
8. 用 30% 甘油-PB 替换溶液，并在 4 °C 下储存至少 2 小时。
9. 在几周内执行步骤 7 中的程序。

7. 冷冻切片和免疫组化

1. 向孔 1 中加入 1000 μL 等体积组织冷冻培养基和 30% 甘油-PB 的混合物，制备 24 孔板。然后，向 2 孔中加入 1000 μL 组织冻存培养基。
2. 将切片转移到孔 1 中，并在 4 °C 下摇动板 1 小时。
3. 将切片转移到孔 2 中，并在 4 °C 下摇动板 1 小时。
4. 用干冰用异戊烷快速冷冻切片，注意不要弯曲切片。将切片储存在 -80 °C 直至冷冻切片。
5. 将切片冷冻切片至 6 μm 的厚度。在显微镜载玻片上干燥后，将切片储存在 -80 °C。
6. 对于抗原修复¹⁷，将切片浸入 10 mM 柠檬酸钠 （pH 6.0） 中，加热至 100 °C 一次，然后在 98 °C 下保持 1 小时。
7. 用蒸馏水充分清洗切片。切片现在已准备好进行免疫组织化学染色。

结果

图 1A 显示了与 BSW 发作相关的染料注射时间进程，峰值超压为 25 kPa。在"Post"方案中，在 FITC-葡聚糖灌注前 2 小时血管内施用伊文思蓝溶液，灌注在 BSW 暴露后 6 小时、1 天、3 天和 7 天进行。在"Pre"方案中，在 BSW 暴露前立即注射埃文思蓝溶液。在"Post"方案中，预计伊文思蓝的浓度将在灌注固定前约 2 小时达到最大值，而在"Pre"方案中，预计会在 BSW 暴...

讨论

使用一种使用 Evans blue 和 FITC-葡聚糖的新型双标记技术来准确可视化 BBB 分解在单个大脑中的精确时空分布。在低强度 BSW 模型中，在检查的大脑中观察到染料外渗的范围、位置和程度的显着变化（图 2 和 图 3）。染料之间的错配显示，BBB 分解在 BSW 暴露后约 3 小时开始，第 1 天发生实质性重塑并持续到第 7 天（

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formalin Neutral Buffer Solution	FUJIFILM Wako Chemicals	062-01661
Anti GFAP, Rabbit	DAKO-Agilent	IR524
Anti Iba1, Rabbit	FUJIFILM Wako Chemicals	019-19741
Chicken anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21200
Cryo Mount	Muto Pure Chemicals	33351	tissue freezing medium
Domitor	Orion Corporation		medetomidine
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10040
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129
Falcon 24-well Polystyrene Clear Flat Bottom Not Treated Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile, 50/Case	CORNING	351147
Fluorescein isothiocyanate–dextran average mol wt 40,000	Sigma-Aldrich	FD40S	FITC-dextran
Glass Base Dish 27mm (No.1 Glass)	AGC TECHNO GLASS	3910-035	35 mm glass bottom dish
IX83 Inverted Microscope	OLYMPUS
MAS Hydrophilic Adhesion Microscope Slides	Matsunami Glass	MAS-04
Matsunami Cover Glass (No.1) 18 x 18mm	Matsunami Glass	C018181
Midazolam Injection 10mg [SANDOZ]	Sandoz
Paraformaldehyde EMPROVE ESSENTIAL DAC	Merck Millipore	1.04005.1000
Peristaltic Pump	ATTO	SJ-1211 II-H
RODENT BRAIN MATRIX Adult Mouse, 30 g, Coronal	ASI INSTRUMENTS	RBM-2000C	brain slicer
Vetorphale	Meiji Animal Health	VETLI5	butorphanol