裂变酵母作为靶向细菌细胞骨架蛋白的抗菌药物筛选平台

摘要

裂变酵母在这里用作异源宿主，将细菌细胞骨架蛋白（如 FtsZ 和 MreB）表达为具有 GFP 的翻译融合蛋白，以可视化其聚合。此外，通过使用荧光显微镜进行成像来识别影响聚合的化合物。

摘要

细菌细胞骨架蛋白（如 FtsZ 和 MreB）执行细胞分裂和细胞形状维持等基本功能。此外，FtsZ和MreB已成为新型抗菌药物发现的重要靶点。已经开发了几种检测方法来鉴定靶向这些细胞骨架蛋白的核苷酸结合和聚合的化合物，主要集中在 FtsZ 上。此外，许多检测要么是费力的，要么是成本高昂的，确定这些蛋白质是否是药物的细胞靶标通常需要多种方法。最后，药物对真核细胞的毒性也是一个问题。在这里，我们描述了一种基于细胞的单步测定法，以发现靶向细菌细胞骨架的新分子，并最大限度地减少可能对真核细胞具有潜在毒性的打击。裂变酵母适用于基于显微镜的高通量筛选，视觉筛选可以轻松识别任何改变 FtsZ 或 MreB 聚合的分子。我们的检测使用标准的 96 孔板，并依赖于细菌细胞骨架蛋白在真核细胞（如裂变酵母）中聚合的能力。虽然这里描述的方案是针对裂变酵母的，并利用来自 金黄色葡萄球 菌的FtsZ和来自 大肠杆菌的MreB，但它们很容易适应其他细菌细胞骨架蛋白，这些细菌细胞骨架蛋白很容易在任何真核表达宿主中组装成聚合物。本文所述的方法应有助于进一步发现靶向细菌细胞骨架蛋白的新型抗菌剂。

引言

目前用于对抗细菌感染的几乎所有抗生素都具有广泛的耐药性，因此迫切需要新型抗生素。2019 年的一份报告指出，抗生素耐药性感染导致 127 万人丧生，考虑到耐药细菌感染的并发症，总共有 495 万人死亡¹。虽然在临床实践中仍然有效，但目前的抗生素库主要针对窄谱细胞过程，主要集中在细胞壁、DNA 和蛋白质合成上。在过去的半个世纪中，只有不到 30 种蛋白质被商业开发为开发新型抗菌剂的靶标 ^2,3。这种有限的可行靶点范围极大地限制了发现新的抗生素或其衍生物以对抗抗生素耐药细菌。因此，为了克服新出现的抗生素耐药性问题，需要开发具有新靶点和作用机制的新型抗生素。

理想情况下，抗菌靶标应该是细菌细胞生长的重要组成部分，在系统发育多样性的物种中是保守的，表现出最少的真核同源性，并且可以使用抗生素⁴。自从发现参与细胞分裂和细胞形状维持的细菌细胞骨架蛋白以来，它们已成为开发抗菌化合物的有前途的焦点⁵。这些蛋白质对细菌活力至关重要，在维持细胞形状（MreB、CreS）、分裂（FtsZ、FtsA）和 DNA 分离（ParM、TubZ、PhuZ、AlfA）方面发挥着关键作用，类似于真核细胞中的细胞骨架。值得注意的是，FtsZ在广泛的原核生物中表现出非常高的保守性水平，而MreB几乎存在于所有棒状细菌中。如此广泛的分布和细胞活力的相关性使这些蛋白质成为抗生素研究中的一个引人入胜的靶标 ^5,6,7。

采用多管齐下的方法至关重要，该方法将体内观察、体外相互作用和酶学实验相结合，以彻底验证细菌细胞骨架蛋白作为潜在抑制剂的主要靶点⁷。繁琐的程序或巨大的成本影响阻碍了许多用于此目的的可用检测。这些是它们在筛选可能影响细菌细胞骨架的先导化合物中广泛使用的显着障碍。其中，显微镜作为一种非常有效和快速的方法脱颖而出，它通过直接检查细胞形态的变化来评估化合物的有效性。然而，靶蛋白与其他细胞骨架复合物的异质结合、脱靶结合和膜电位变化导致的间接影响、难以有效穿透细胞以及外排泵的存在，尤其是在革兰氏阴性细菌中，使得确定细菌细胞变形的确切原因变得总体复杂 ^8,9,10。

裂殖酵母，或俗称的裂变酵母，是一种杆状单细胞真核生物。裂变酵母在细胞和分子生物学中被广泛用作模式生物，因为在细胞过程（如细胞周期和分裂、细胞组织以及与高等真核生物（包括人类）的染色体复制中具有非凡的保守性^11,12。此外，Errington及其同事在裂变酵母中表达了极点定位的细菌细胞骨架蛋白DivIVA，以证明DivIVA积累在负曲面上¹³。同样，Balasubramanian和团队首次将裂变酵母建立为细胞模型系统，以为大肠杆菌肌动蛋白细胞骨架蛋白（如MreB¹⁴和微管蛋白同源物FtsZ¹⁵）的机制、组装和动力学带来新的见解。他们还证明了 A22 在酵母¹⁴ 中表达时通过落射荧光显微镜有效阻止 MreB 聚合的能力。在此之后，其他研究小组也成功地利用裂变酵母研究了叶绿体 FtsZ1 和 FtsZ2 蛋白的组装特性¹⁶。最近，我们通过全面评估三种已知的 FtsZ 抑制剂（血根碱、小檗碱和 PC190723-on FtsZ 蛋白）的影响，建立了使用裂变酵母作为细胞平台特异性筛选细菌细胞骨架抑制剂的概念验证，这些蛋白来自两种致病细菌，即金黄色葡萄球菌和幽门螺杆菌 ¹⁷.此外，这种基于细胞的单步法检测被证明有助于最大限度地降低识别可能对真核细胞具有潜在毒性的化合物的风险。

在本报告中，利用裂变酵母系统，我们提出了一种系统的工作流程，使用标准 96 孔板进行半自动筛选和定量小分子抑制剂靶向 金黄色葡萄球 菌 FtsZ 和 大肠杆菌 MreB 的作用。在这里，我们使用已建立的抑制剂 PC190723 和 A22 分别专门针对 FtsZ 和 MreB 来设置和优化半自动工作流程。该工作流程使用配备电动高精度载物台的落射荧光显微镜和标准 96 孔板中的自动图像采集，以改进当前的标准化。因此，它可以应用于合成化学库的中通量和高通量筛选，并规避了上述一些挑战。

研究方案

1. GFP标记的细菌细胞骨架蛋白在鲳鱼中的表达

注：有关此处使用的所有质粒和菌株的信息，请参阅 表1 。请参阅 表 2 了解所有介质成分。

1. 使用N端GFP融合（GFP-MreB）和携带C端GFP（SaFtsZ-GFP）的金黄色葡萄球菌FtsZ克隆大肠杆菌MreB到具有中等强度硫胺素抑制启动子nmt41^18,19的大肠杆菌表达载体pREP42中，如前所述^14,15。如^20,21中所述，从大肠杆菌菌株（DH10β）中维持，扩增和分离质粒。
   注：也可以使用其他 大肠杆 菌菌株，如DH5α、XL1Blue、TOP10等或其他常规用于分子克隆的市售感受态细胞。
2. 质粒pREP42-GFP-EcMreB和pREP42-SaFtsZ-GFP转化为 鲳鱼链球菌
   1. 使用醋酸锂方法²²将质粒pCCD3（pREP42-GFP-EcMreB）和pCCD713（pREP42-SaFtsZ-GFP）转化为庞贝链球菌株（^h-leu1-32 ura4-D18），如以下步骤所述。
   2. 第 1 天 - 初次培养：将一环新鲜条纹的 S. pombe 培养物接种到 3 mL 高压灭菌酵母提取物和补充剂 （YES） 肉汤中。将其在30°C（O / N）的轨道振荡器中孵育过夜。
   3. 第2天：
      1. 二次培养：将约 500 μL 原代培养物加入 30 mL 高压灭菌的 YES 肉汤中。在30°C下孵育3-4小时，振荡至OD₆₀₀ 达到0.4-0.6。
         注：对于每次转化，使用 30 mL。
      2. 在室温下以 2,500 x g 沉淀 30 mL 培养物 6-8 分钟。弃去上清液并用 50 mL 无菌蒸馏水 （D/W） 洗涤细胞。再次沉淀并丢弃上清液。将细胞重悬于 1 mL 无菌 D/W 中，并将其转移到 2 mL 离心管中。如上离心，弃去上清液。
      3. 加入 1 mL 0.1 M 醋酸锂、Tris-EDTA （LiAc-TE） 溶液并如上所述离心。弃去上清液并重悬于 1 mL 的 0.1 M LiAc-TE 中。离心并弃去上清液，留下 100 μL 溶液。
      4. 加入 10 - 20 μg 载体 DNA（鲑鱼精子 DNA;在冰上变性并快速冷却）和 2 - 3 μg 需要转化的质粒 DNA。轻轻混合。在室温下孵育 10 分钟。
      5. 加入 260 μL 40% PEG/LiAc-TE;轻轻混合。在振荡器或30°C的热混合器中孵育60分钟，轻轻混合。加入 43 μL DMSO;轻轻混合。
      6. 在热混合器中在42°C下热休克10分钟。以2,500× g 沉淀6-8分钟，弃去上清液。用 1 mL 无菌 D/W 洗涤沉淀 1 次。
      7. 沉淀，弃去上清液并将沉淀重悬于200μL无菌D / W中。 板100μL在含有5μg/ mL硫胺素（抑制 nmt41 启动子）和氨基酸补充剂腺嘌呤（0.225mg / mL），组氨酸（0.225mg / mL）和亮氨酸（0.225mg / mL）但缺乏尿嘧啶（pREP42质粒的选择标记）。
         注：交替，将 70 μL 和 130 μL 板放在两个不同的板中。接种两种不同体积（70 μL 和 130 μL）以在至少一个板上获得分离的菌落，具体取决于转化效率，转化效率可能因实验而异。
      8. 将板在30°C孵育2-3天，直到菌落出现。将单个菌落与 100 μL 无菌 D/W 混合，并铺在含有硫胺素但缺乏尿嘧啶的新鲜 EMM 板上，如上所述。
      9. 在30°C孵育2-3天，直到出现完整的草坪。使用接种环废弃生长的细胞草坪，并将其重悬于冻存瓶中含有 30% 甘油的 1 mL YES 培养基中。
      10. 在液氮中快速冷冻冷冻冻存瓶并储存在-80°C以保存冷冻酵母储备液。
3. 细菌细胞骨架蛋白在裂变酵母中的表达
   1. 将甘油原液中的一块无菌划线到新鲜的酵母特异性板上，以获得足够的培养物用于进一步的实验。
      注意：在 pREP42 的情况下，我们使用含有腺嘌呤、组氨酸和亮氨酸的 EMM 琼脂平板（最小培养基）（使用 S. pombe 菌株 （h-leu1-32 ura4-D18））而不使用尿嘧啶（尿嘧啶存在于 pREP42 中作为选择标记）。我们将 15 - 20 μM 硫胺素添加到琼脂平板中（因为 pREP42 具有硫胺素可抑制的 nmt41 启动子），以在平板上生长时抑制目的基因的表达。
   2. 将来自条纹贴片的一小环接种物接种到缺乏硫胺素的5mL酵母特异性EMM培养基中，并在30°C下孵育10-12小时。
      注：在 nmt41 启动子下，不同物种的 FtsZ 和 MreB 在 S. pombe 中的表达可能有所不同，通常为 16 至 30 小时。在不带硫胺素的情况下，GFP-EcMreB和SaFtsZ-GFP在30 °C下蛋白表达的最佳时间分别为20 - 24 h和16 - 20 h。

2. 表达 GFP 标记的细菌细胞骨架蛋白 的 S. pombe 培养物的处理

注：在 96 孔板中对过夜培养的酵母培养物测试许多不同的药物分子。

1. 通过使用半自动 96 孔多通道移液仪器将 50 μL 过夜培养物转移到含有 150 μL 新鲜酵母 EMM 培养基的 96 孔板的每个孔中来接种新鲜培养物。
2. 在使用半自动 96 孔多通道移液器移入和移出以进行适当混合时，缓慢地将不同浓度的药物引入生长培养物中，每个药物一式三份，如图 1 中的示意图所示。
3. 作为阳性对照，使用已知的药物，PC190723用于（金黄色葡萄球菌 FtsZ）和 A22（用于 大肠杆菌 MreB）一式两份。
   注：如前所述，PC190723和A22的浓度分别为56.2μM¹⁷和72.6μM ^14,17。同时，A22处理SaFtsZ和PC190723处理EcMreB分别为阴性对照。
4. 根据药物的最低和最高浓度，使用DMSO作为三种不同浓度的溶剂对照。
   注：溶解药物的溶剂用作溶剂对照。
5. 将对照和处理过的培养物在30°C孵育6-10小时（直到细胞显示细菌荧光蛋白的表达），然后使用落射荧光显微镜成像。

3. 聚合物的可视化

1. 将 20 μL 1 mg/mL 刀豆球蛋白 A 的包被涂在光学透明的底部 96 孔板（用于荧光成像的黑壁）的每个孔中，并在室温下孵育 20 分钟。吸出液体，让它风干 10 分钟。
2. 将 20 μL 细胞从培养板转移到每个相应的孔中，静置 10 分钟。用无菌 EMM 培养基洗涤细胞 3x-4x。
3. 在要使用的物镜就位（参见步骤 3.6）的情况下，使用图像采集软件采集面板中的导航器模式进行 96 孔板对准和孔覆盖。在导航器上对齐孔边缘。
4. 接下来，选择孔覆盖参数，其中包括孔中感兴趣区域的多位置选择，并使用具有按需模式的自适应自动对焦控制，以在成像过程中保持样品对焦。
5. 使用微分干涉对比 （DIC） 和荧光采集图像。分别设置475/28nm和525/48nm的激发和发射滤光片，以对酵母中表达的GFP标记的细菌蛋白进行成像。通过酵母细胞的厚度（5μm），以0.2μm的步长获得Z-stacks。
6. 使用配备 100x、1.4-NA 油浸物镜和 2,000 x 2,000 sCMOS 相机（6.5 μm x 6.5 μm 像素尺寸）的倒置落射荧光显微镜捕获图像。使用 LED 照明系统激发荧光团。
   注：任何具有用于 96 孔板的电动载物台的落射荧光显微镜系统都应该是合适的，该平台具有精确的多点定位。在1×1的分档和15%-20%的照明下，以相似的曝光时间（通常在0.3-0.5秒的范围内）获取对照和药物处理的所有细胞图像，以最小化实验变量并保持一致性。

4. 使用 ImageJ 对图像进行量化

1. 处理细胞图像并测量 FtsZ¹⁷ 的每个细胞的斑点数和密度。在 MreB 的情况下，测量密度和各向异性²³ ，并使用 Fiji （v2.0.0-rc-69/1.52p）²⁴ 比较对照细胞和处理过的细胞。
2. 使用 DIC 通道中的图像，首先使用手绘工具勾勒出单个酵母细胞的轮廓，然后在 ROI 管理器中另存为感兴趣区域 （ROI）。此步骤尚未自动化，但可以尝试使用机器学习^25,26 的最近开发的工具，并在不久的将来进行整合。
3. 如²⁷ 中所述，遮罩单元格的外部区域并填充黑色。
4. 使用 OPS 阈值 IJ1 分析宏（斐济的内置功能）来计算点数²⁴。
5. 使用 otsu 方法进行自动阈值设置并屏蔽分割的粒子。使用宏运行插件分析颗粒。
6. 为了测量聚合物密度（细胞中每单位面积的细胞骨架量），如所述处理图像，包括掩蔽和骨架化步骤^27,28。在 lpx 插件中使用 Lpx 2Dfilter 对图像进行骨架化。
7. 有关详细信息，请查看最近的出版物¹⁷。如前所述²³中所述执行EcMreB聚合物定量，如前所述²³，使用各向异性使用FibrilTool²⁹量化空间组织。
   注：这些分析方法可用于量化经药物处理或未经处理的任何其他细菌细胞骨架蛋白。

结果

设置用于药物筛选的 96 孔板
先前已经确定使用S. pombe从含有中等强度硫胺素可抑制启动子nmt41的载体（pREP42）中表达C-末端GFP标记的金黄色葡萄球菌FtsZ17，同样，用N-末端GFP标记的大肠杆菌MreB也在S. pombe¹⁴中表达。我们还表明，PC190723（SaFtsZ 的特异性抑制剂）和 A22（MreB 抑制剂）在酵母^14,17

讨论

抗微生物药物耐药性（AMR）是一种严重的全球健康威胁，迫切需要具有新靶点的新型抗生素。细菌细胞骨架已成为开发新抗生素的一个有吸引力的靶点，细胞分裂蛋白FtsZ的小分子抑制剂，如TXA709，已经处于I期临床试验³⁰。已经开发了几种方法来鉴定 FtsZ 聚合抑制剂 ^7,31。我们最近在基于细胞的测定中使用真核裂变酵母表明，FtsZ 稳定药...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black	Thermo Scientific™	160376
96-well plate	Corning	CLS3370
A22 Hydrochloride	Sigma	SML0471	Dissolved in DMSO
Adenine	FormediumTM	DOC0229	225 mg/L of media
Concanavalin A	Sigma	C5275-5MG
DMSO	Sigma	317275
Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth)	FormediumTM	PMD0210	See below for composition
EDTA	Sigma	EDS-500G
epMotion® 96 with 2-position slider	Eppendorf	5069000101
Histidine	FormediumTM	DOC0144	225 mg/L of media
Leica DMi8 inverted fluorescence microscope	Leica Microsystems		German company
Leucine	FormediumTM	DOC0157	225 mg/L of media
Lithium acetate	Sigma	517992-100G
PC190723	Merck	344580	Dissolved in DMSO
Polyethylene glycol (PEG)	Sigma	202398
Thiamine	Sigma	T4625	Filter sterilised
Tris-Hydrochloride	MP	194855
Uracil	FormediumTM	DOC0214	225 mg/L of media, Store solution at 36°C
YES (Yeast extract + supplements) Agar	FormediumTM	PCM0410	See below for composition
YES (Yeast extract + supplements) Broth	FormediumTM	PCM0310	See below for composition
Yeast (S. pombe) media
Yeast extract + supplements (YES)
	Composition	g/L
	Yeast extract	5
	Dextrose	30
	Agar	17
	Adenine	0.05
	L-Histidine	0.05
	L-Leucine	0.05
	L-Lysine HCl	0.05
	Uracil	0.05
Edinburg minimal medium (EMM)
	Composition	g/L	concentration
	potassium hydrogen phthallate	3	14.7mM
	Na2HPO4	2.2	15.5 mM
	NH4Cl	5	93.5 mM
	glucose	2% (w/v) or 20 g/L	111 mM
	Salts (stock x 50)	20 mL/L (v/v)
	Vitamins (stock x 1000)	1 mL/L (v/v)
	Minerals (Stock x 10,000)	0.1 mL/L (v/v)
Salts x 50	52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M)	52.5	0.26 M
	0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM)	0.000735	4.99 mM
	50 g/l KCl (0.67 M)	50	0.67 M
	2 g/l Na2SO4 (14.l mM)	2	14.1 mM
Vitamins x 1000	1 g/l pantothenic acid	1	4.20 mM
	10 g/l nicotinic acid	10	81.2 mM
	10 g/l inositol	10	55.5 mM
	10 mg/l biotin	0.01	40.8 µM
Minerals x 10,000	boric acid	5	80.9 mM
	MnSO4	4	23.7 mM
	ZnSO4.7H2O	4	13.9 mM
	FeCl2.6H2O	2	7.40 mM
	molybdic acid	0.4	2.47 mM
	KI	1	6.02 mM
	CuSO4.5H2O	0.4	1.60 mM
	citric acid	10	47.6 mM
Strains/ Plasmids
Strains	Description	Reference
CCD190	Escherichia coli DH10β	Invitrogen
CCDY4	MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB	Srinivasan et al., 2007
CCDY340	CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP	Sharma et al., 2023
CCDY346	MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]	Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plasmids
pCCD3	pREP42-GFP-EcMreB	Srinivasan et al., 2007
pCCD713	pREP42-SaFtsZ-GFP	Sharma et al., 2023