实时成像量化患者来源的肿瘤类器官中的细胞放射敏感性

摘要

在这里，我们详细介绍了一种简单的实时成像方法，用于量化患者来源的肿瘤类器官对电离辐射的敏感性。

摘要

放射治疗 （RT） 是现代临床癌症管理的主要手段之一。然而，并非所有癌症类型对辐射都同样敏感，这通常（但并非总是）是因为恶性细胞修复电离射线引起的氧化 DNA 损伤的能力存在差异。几十年来，克隆形成测定一直被用于评估培养的癌细胞对电离照射的敏感性，这主要是因为受照射的癌细胞通常以延迟方式死亡，这很难用短期流式细胞术或显微镜辅助技术进行量化。不幸的是，克隆形成检测不能用于更复杂的肿瘤模型，例如患者来源的肿瘤类器官 （PDTO）。事实上，照射已建立的 PDTO 不一定会消除它们作为多细胞单位的生长，除非它们的茎状隔室被完全根除。此外，在已建立的 PDTO 的情况下，照射 PDTO 衍生的单细胞悬液可能无法正确概括恶性细胞对 RT 的敏感性。在这里，我们详细介绍了对常规克隆形成测定的改编，其中包括将已建立的 PDTO 暴露于电离辐射，然后进行单细胞解离，在合适的培养条件下重新铺板和实时成像。未照射（对照）PDTO 衍生的干细胞样细胞以 PDTO 特异性效率重组生长中的 PDTO，该效率以剂量依赖性方式受到照射的负面影响。在这些条件下，PDTO 形成效率和生长速率可以量化为对收集的延时图像的放射敏感性的量度，直到对照 PDTO 达到预定义的空间占用。

引言

外照射放射治疗 （RT） 是现代肿瘤学的支柱之一，它不仅反映了明显的抗癌活性，而且反映了与明确定义的通常可控的副作用谱相关的抗癌活性¹，而且还反映了异常广泛的临床可用性（发达国家的大多数癌症中心都配备了用于外照射 RT 的现代直线加速器）².根据这一概念，RT 在全球范围内成功用于治疗目的（通常在早期疾病 ^3,4 和姑息性应用中），以控制转移性肿瘤的症状（例如疼痛）⁵。也就是说，并非所有恶性肿瘤对 RT 都同样敏感，这反映了许多癌细胞内在和微环境特征 6,7,8,9。作为一个独立的例子，影响 DNA 修复和氧化还原稳态的各种癌症相关遗传和表观遗传改变与内在放射敏感性的增加或降低有关，这在很大程度上反映了 RT 通过对 DNA 和其他大分子造成直接和活性氧 （ROS） 依赖性损伤来杀死癌细胞的能力 10,11,12,13。

研究方案

研究中使用的试剂和设备列在 材料表中。

1. 类器官培养

注意：TNBC#1 PDTO 是在我们的实验室中建立的，基于从三阴性乳腺癌 （TNBC） 患者手术切除的肿瘤组织，该患者提供知情同意参与生物样本库方案 （IRB21-06023682）。经组织学和 RNA 测序 （RNAseq） 验证后，将 TNBC#1 PDTO 在富集的 DMEM/F12 培养基（表 1）中培养在 66% 基质胶滴（所谓的“圆顶”）中，并以 1：2-1：10 的比例每 2-3 周传代^{一次 28}。

1. 在照射前约 2 周，以 1：2-1：10 的比例在单独的、非粘附的 6 孔板中播种 PDTO，每个测试的辐射剂量一个（加上阴性对照，这将由未暴露于电离辐射的 PDTO 提供）。
2. 每 3-4 天向 PDTO 中加入 3 mL 新鲜富集的 DMEM/F12 培养基。
   注：接种和培养条件可能需要一些调整，以防止 PDTO 获得非常可识别的环状外观，这表明在显微镜下存在核心坏死，并确保照射时的最佳活力。

2. 辐射

讨论

在这里，我们描述了一种对常规克隆形成测定的改编，它利用乳腺癌 PDTO 和实时成像来量化 PDTO 放射敏感性，基于 （1） 形成 PTDO 的干细胞样细胞在 体外 PDTO 照射下的持久性，以及 （2） 这些细胞（可能）产生的 PDTO 的生长速率。该协议的关键步骤包括 （1） 将 PDTO 建立到圆顶占用率，以实现良好的生存能力，（2） PDTO 暴露于不同剂量的电离照射，包括模拟辐照?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm mesh filter	Thomas Scientific	1164H35
B27	Invitrogen	17504-044
Cellometer Auto T4 Bright Field Cell Counter	Nexcelom
DMEM F/12	Corning	12634-010
Epidermal Growth Factor hEGF	Peprotech	AF-100-15
EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope	Thermo Fisher Scientific	12-563-460
FGF10	Peprotech	100-26
FGF7	Peprotech	100-19
GlutaMax	Invitrogen	35050061
Hepes	Invitrogen	15630-080
IncuCyte software 2021A	Sartorius		version: 2021A
Incucyte SX1	Sartorius		model SX1
Incucyte validated 48 well plate	Corning	3548
Matrigel	Discovery Labware	354230
nAc	Sigma Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Noggin			Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Non-treated 6 well plate	Cellstar	657 185
NR (Heregulin)	Peprotech	100-03
p38 MAP inhibitor p38i SB202190	Sigma Aldrich	S7067
PBS	Corning	21-040-CV
PenStrep	Invitrogen	15140-122
Primocin	Invivogen	ant-pm-1
Rspondin Media			Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Small Animal Radiation Research Platform (SARRP)	Xstrahl Ltd
TGFbeta Receptor Inhibitor A83-01	Tocris	2939
Trypan blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-61
TrypLE	Gibco	112605-028
Y-27632 (RhoKi)	Selleck	S1049