基底膜基质封装细胞聚集用于研究小鼠脾脏组织形成

摘要

本文描述了一种在半固体基底膜基质中聚集和封装脾细胞的方案。基底膜基质构建体可用于三维培养，用于研究类器官发育，或用于 体内 移植和组织再生研究。

摘要

脾脏是一种免疫器官，在血液传播的免疫反应中起着关键作用。这种组织的解剖学或功能丧失增加了对严重血液感染和败血症的易感性。脾脏切片的自体移植在临床上已被用于补充丢失的组织并恢复免疫功能。然而，驱动强大且具有免疫功能的脾组织再生的机制尚未完全阐明。在这里，我们旨在开发一种在半固体基质中聚集和封装脾细胞的方法，以研究脾组织形成的细胞需求。基底膜基质封装的细胞构建体既适用于三维类器官的 体外 组织培养，也适用于肾囊下的移植，以直接评估 体内 组织的形成。通过操纵输入细胞进行聚集和封装，我们证明了在动物移植模型下，移植来源的PDGFRβ ⁺ MAdCAM-1^- 新生儿基质细胞是脾组织再生所必需的。

引言

脾脏的创伤性破裂和体内多个脾结节的出现是脾组织具有再生能力的最初迹象之一^1,2。脾脏自体移植后来被引入临床，以保留需要紧急脾切除术的患者的脾脏组织³.然而，尽管几十年来一直是临床实践的一部分，但人们对脾脏如何再生知之甚少。动物移植模型提供了对脾脏再生和免疫功能的多个参数^{的见解 4,5}。特别是，对移植物制备方法的实验修改允许在细胞和分子水平上更详细地研究组织再生。

涉及整个脾脏切片的移植在重建新的脾脏结构之前会经历一个集体坏死阶段⁶.移植物坏死的初始阶段表明，移植组织的大部分主要由红细胞和白细胞组成，对于脾脏再生是不必要的。这是通过在小鼠肾囊下移植之前从脾移植物中排除造血细胞来研究的。在这里，脾脏的非白细胞/非红细胞部分（包括基质细胞和内皮细胞）被证明足以诱导从头组织形成⁷。脾基质组织可以进一步加工成单细胞悬浮液，从而能够使用细胞分选技术来操纵细胞移植物组成。通过选择性地去除候选细胞类型，鉴定出两种对移植物发育不可或缺的 CD45-TER-119^- 基质细胞群:内皮样 CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺ 细胞群和更广泛定义的 PDGFRβ⁺ 间充质细胞群⁸。

脾细胞移植物的构建在支持材料和细胞加载过程方面各不相同。组织工程脾脏先前是通过将脾脏单位加载到聚乙醇酸/聚L乳酸聚合物支架^上来制备的^5,9。有趣的是，吸收到胶原海绵中的脾脏基质细胞未能移植，而基质细胞聚集并加载在胶原片上促进了脾脏再生⁸。在三维培养条件下，脾脏基质细胞在基质基质内的重悬也被证明可以诱导细胞聚集¹⁰。然而，这种方法尚未在移植模型中使用。当前方案的总体目标是将脾脏基质细胞直接聚集在基底膜基质内，随后可以将其转移到三维体外组织培养系统中或用作动物模型移植的载体（补充图1）。

研究方案

所有动物程序均根据昆士兰大学动物伦理委员会（UQBR/079/19）批准的实验方案进行。

1.组织采集和基质细胞制备

1. 通过将动物包裹在薄纸内并将它们置于碎冰下>10分钟，诱导体温过低，对0.5-1.5日龄的雄性和/或雌性BALB / c新生供体小鼠实施安乐死。
   注意:该协议可以适应不同的小鼠品系，年龄和动物数量。
2. 准备无菌手术器械。
3. 将鼠标放在右侧位置。用80%乙醇擦拭皮肤，并用Iris手术剪刀切开1厘米，露出腹膜壁。
4. 在脾脏上方做第二个 0.5 厘米的切口，然后用一把细镊子轻轻地将组织抬起。用一把手术剪刀剪断血管并切除组织。将组织转移到含有冰冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）的培养皿中。去除附着在脾脏上的任何残留结缔组织。
   注意:体视显微镜可以帮助操作手术器械所需的精细运动。
5. 为了解离整个组织，将新生儿脾脏（10 个或更少的池）转移到倒置的 14 mL 锥形管盖的内缘。使用 1 mL 注射器柱塞的塑料后端通过按压运动机械破坏组织。
6. 将盖子紧紧固定在含有 10 mL 冷 PBS 的 14 mL 锥形管上。将试管倒置 5 次，将所有被破坏的组织从盖子洗入试管中。
7. 对任何剩余组织重复步骤 1.6。
8. 将试管放在冰上 1 分钟，让组织沉降到试管底部。
9. 通过将溶液通过可逆的70μm细胞过滤器，小心地弃去上清液（含有造血细胞）。
10. 使用新鲜制备的 2 mL 补充的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （sDMEM） 回收不溶性基质部分，该培养基质部分含有 1 mg/mL 胶原酶 IV、40 μg/mL DNase I 和 2% 胎牛血清 （FBS）。
    注意:胶原酶 IV 和胶原酶 D 是有害物质，必须在生物安全柜内使用适当的个人防护设备进行处理。
11. 为了制备单细胞悬浮液，在37°C下以恒定旋转酶消化合并组织（最多20）10分钟。
12. 将 4 mL 含有 1 mg/mL 胶原酶 D、40 μg/mL DNase I 和 2% FBS 的新鲜制备的 sDMEM 直接加入含有基质组织的试管中。在37°C下再孵育10分钟，并不断旋转。
13. 通过加入 8 mL 冰冷的 PBS 停止消化。通过在4°C下以200× g 离心5分钟来收集细胞。
14. 弃去上清液，并通过重悬于1mL冷PBS中并在4°C下以200× g 离心5分钟来洗涤细胞两次。 将细胞保持在冰上。
    注意:可以对细胞进行计数并调整到所需的浓度。这可能需要针对不同的细胞群进行优化。使用该方案，通常恢复0.5 x 10^6-1 x 10⁶ 基质细胞/脾脏，具体取决于供体小鼠的年龄。在此阶段可以选择对细胞进行染色和 FACS 分选，以确定细胞组成。

2. 细胞聚集体的基质封装

1. 在-20°C冰箱内预冷无菌P200移液器吸头。
2. 将柔性实验室薄膜（例如，封口膜）切成 1 cm x 2 cm 的小块，并通过浸入 80% 乙醇中 10 分钟进行灭菌，然后用 PBS 灭菌 10 分钟。实验室胶片可以提前制备并无菌储存。
3. 通过在4°C下以200×g离心5分钟来制备0.5×106-2.5×106^细胞。 小心地吸出上清液，留下约20μL剩余的PBS体积。将细胞沉淀放在冰上。
   注意:可以在不干扰细胞沉淀的情况下轻轻吸出剩余的PBS以确认体积。
4. 使用 P20 移液器将 2 μL 冰冷基底膜基质吸入预冷的 P200 移液器吸头中。
   注:高浓度基底膜基质（例如，康宁基质胶基质高浓度基质）有助于形成坚固的固化塞。
5. 轻轻扭转以弹出移液器吸头。拉伸预先灭菌的实验室薄膜条，并将其放在移液器吸头的末端，注意不要刺穿薄膜。继续将吸头包裹在薄膜中以密封移液器吸头。小心地将密封的尖端直接放在冰上，注意不要使薄膜破裂。
6. 将细胞沉淀重悬于剩余的PBS中，并将溶液轻轻地分层在基底膜基质上。将结构保持在冰上。
7. 通过将 1.2 mL 簇状管放入 14 mL 锥形管中来制备离心管。
8. 将移液器吸头置于嵌套管配置中，并在400× g 和4°C下离心5分钟。
9. 将14mL锥形管垂直放置，并在37°C下孵育15分钟，以使基底膜基质在移液器吸头内固化。
   注意:14 mL 锥形管可以放在冰上，直到下游应用需要为止。

3.三维类器官培养

1. 小心地从移液器吸头上取下实验室薄膜。
2. 将细不锈钢丝柱塞插入移液器吸头的较大开口。
3. 将基质塞排出，直到通过尖端释放到未经处理的 6 孔组织培养板的一个孔中，该培养板含有 2 mL sDMEM，补充有 10% FBS、1x Glutamax、1x 非必需氨基酸 （NEAA）、10 μM Rock 抑制剂、10 U/mL 青霉素/链霉素和 50 μM β-巯基乙醇。
   注意:组织培养容器和相应的培养基体积可以根据需要进行调整。
   注意:NEAA、青霉素/链霉素和 β-巯基乙醇是有害物质，必须在生物安全柜内使用适当的个人防护设备进行处理。
4. 在37°C，5%CO₂和95%湿度下培养类器官4-12周。
5. 每 5 天更换一半的培养基。
   注意:如果类器官开始附着在组织培养板上，请转移到新鲜孔中。

4.肾包膜移植

1. 准备无菌手术器械。
2. 对基底膜基质塞进行包膜下肾移植:
   1. 按照机构动物伦理指南用异氟醚麻醉 8 周龄 BALB/c 雌性受体小鼠。
      注意: 异氟烷是一种有害物质。必须清除废气，以防止进入工作空间环境。
   2. 将鼠标放在右侧位置。
   3. 剃掉手术部位的毛发，并按照机构指南对皮肤进行消毒。
      注意: 建议使用碘基或氯己定基和酒精基交替擦洗以圆周运动对手术部位进行三次消毒。
   4. 在垂直于脊柱的皮肤上做一个 2 厘米的切口，露出腹膜壁。
      注意:可以使用细手术剪刀或手术刀刀片进行皮肤切口。用户应遵守机构动物伦理准则或标准操作程序。
   5. 在肾脏上方的腹膜壁上做一个 0.5 cm 的小切口。
      注意:切口应近似于肾脏宽度，以确保肾脏在移植过程中保持外部化。
   6. 用拇指和食指向下按压，通过腹膜开口使肾脏外部化。可以使用一对环形镊子来辅助外部化。通过定期使用棉签涂抹无菌 PBS，确保肾脏在整个过程中保持湿润。
   7. 在立体显微镜下，用一对弯曲的超细镊子在肾脏的一极捏住肾包膜的肾周脂肪。使用第二对弯曲的超细镊子以相反的方向轻轻地向上撕裂肾囊膜，形成一个小开口。
   8. 小心地将一个镊子的插脚插入胶囊膜下方。使用缓慢的扫掠运动将包膜与肾实质分离。
   9. 通过从移液器吸头去除实验室薄膜来准备用于移植的基底膜基质塞。
   10. 使用镊子的一个插脚提起肾囊，然后将移液器尖端插入开口，将其推向肾脏的另一极。
   11. 将一根丝柱塞插入移液器吸头并排出基质塞，同时将移液器吸头从肾脏中取出。
   12. 用PBS润湿肾脏并重新内化。
   13. 用一个 5-0 Vicryl 缝合线闭合腹膜壁，并用两个自动夹闭合皮肤。
   14. 给予镇痛药（丁丙诺啡 0.05-0.1 mg/kg 皮下注射或遵循机构动物伦理指南）。
       注意: 丁丙诺啡是一种有害物质，必须使用适当的个人防护设备进行处理。
3. 关闭异氟醚的流动，但保持氧气流动，让小鼠呼吸纯氧，直到它开始获得意识。
4. 将鼠标放回笼子。在恢复期间，通过将笼子部分放置在加热垫顶部或加热灯下来保持动物温暖，并监测直到小鼠从麻醉中完全恢复。
5. 在前两周或按照机构指南的要求监测术后恢复情况。

结果

细胞聚集对于促进细胞间接触和信号传导很重要。将细胞聚集体包裹在基底膜基质内支持体 外 组织类器官形成的三维培养物，并促进细胞机械递送至肾囊进行移植。为了建立这些结构，首先在冰冷条件下将基底膜基质保持在流体状态。随后通过在上方分层浓缩细胞悬浮液并使用离心力推动细胞通过高密度基质来实现细胞聚集。需要优化离心速度（200-2000 x g）以实现中间层细胞定位?...

讨论

新生儿脾细胞在半固体培养基内的聚集代表了产生脾脏结构的可行方法。类似的基于基底膜基质的方案已被用于启动三维脾培养^物10。在这里，我们证明了脾脏结构同样适用于 体外 类器官培养系统以及 体内 移植模型。值得注意的是， 体外 培养的脾脏类器官的移植尚未经过测试，但确定全部或部分脾组织再生的能力将是有意义的。该协议还继承了先前脾移?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes	Corning	CLS4401	For placing inside a 14 ml conical tube
B-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Stock 55 mM, use at 50 uM
Collagenase D	Roche	11088858001
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	From Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered
Eclipse 200 μl Pipette Tips	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, use at 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140076	Stock 100X, use at 1X
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin
Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27216	70 μm
Ring Tweezers	NAPOX	A-26	Ring size: 3 mm
Rock Inhibitor (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge	Thermofisher		Acceleration and deceleration speeds were set to 8
Ultra Fine Tweezers	EMS	78340-51S	Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish.
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Long Wire Plunger	Drummond	5-000-2002-L	Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long
Wound Clip Applier	MikRon	427630
Wound Clips	MikRon	427631	9 mm