脓毒症诱导的小鼠废用肌病的临床前模型

摘要

这种小鼠模型将脓毒性损伤与后肢肌肉废用相结合，以概括典型脓毒性患者卧床不起的特征。该模型与以前研究脓毒症肌肉功能障碍的模型有很大不同，并且是解决治疗这种情况的治疗策略的可重复方法。

摘要

脓毒症是院内死亡的主要原因。治疗的改善导致脓毒症幸存者的数量增加。大约 75% 的幸存者出现肌肉无力和萎缩，增加了再入院和死亡率的发生率。然而，可用的脓毒症临床前模型并未解决骨骼肌废用问题，这是脓毒症诱发的肌病发展的关键组成部分。我们在该协议中的目标是为小鼠模型提供分步指南，该模型再现卧床不起的脓毒症患者所经历的临床环境。雄性 C57Bl/6 小鼠用于开发该模型。小鼠接受盲肠结扎和穿刺 （CLP） 以诱导败血症。CLP 后 4 天，小鼠后肢悬吊 （HLS） 7 天。将结果与假匹配手术和/或行走正常 （NA） 的动物进行比较。解剖肌肉用于 体外 肌肉力学和形态学评估。该模型导致明显的肌肉萎缩和无力，在脓毒症患者中观察到类似的表型。该模型代表了一个测试缓解脓毒症诱发的肌病的潜在治疗策略的平台。

引言

脓毒症是一种危及生命的疾病，由于过度活跃的免疫反应会对多个器官系统产生不利影响，给全球卫生系统带来重大负担¹。最近，由于重症监护病房 （ICU） 管理的改善，与脓毒症相关的院内死亡率有所下降 ^1,2。然而，大约 75% 在最初的脓毒性损伤中幸存下来的患者会出现骨骼肌萎缩（例如，横截面积减少）和虚弱（例如，力量产生能力降低）^3,4。这种现象被描述为败血症引起的肌病，与身体活动受损和缺乏独立性来完成日常生活任务高度相关，导致在首次发作后的五年内再次住院和死亡⁵。

由于侵袭性和全身性感染，脓毒症患者在 ICU 中恢复时需要长时间卧床休息。在这种情况下，骨骼肌严重废用，这可能会加剧肌肉萎缩和虚弱 ^3,4。目前，没有治疗方法能有效解决脓毒症引起的肌病。旨在解决肌病的可用临床前模型使用了盲肠结扎和穿刺 （CLP）⁶、盲肠浆⁷ 或注射纯化脂多糖 （LPS），这是革兰氏阴性菌细胞壁的组成部分⁸。尽管这些模型成功地传递了感染，但除了在败血症动物中观察到的身体活动自然减少之外，它们并不能正确再现在脓毒症宿主中观察到的肌肉废用⁹。

本研究的主要目的是详细描述如何正确执行脓毒症诱导的小鼠废用肌病模型。我们证明了将 CLP 作为脓毒症模型与后肢悬吊 （HLS） 作为废用模型相结合以研究脓毒症诱导的小鼠肌病的可行性³.此外，还提供了响应模型的肌肉力学和典型形态变化的代表性结果。

研究方案

这些程序已由佛罗里达大学 IACUC （#202200000227） 审查和批准。本研究使用雄性 C57BL/6J 小鼠，17 周龄，体重从 27 g 到 34 g 不等。该协议中概述的实验程序和时间表如图 1 所示。如前所述，该协议总共持续 11 天。动物在第 0 天接受存活手术 （CLP/Sham），然后进行 4 天的液体和镇痛支持。在第 4 天，动物开始持续 7 天的 HLS。终端实验在第 11 天进行。材料 表中列出了试剂和所用设备的详细信息。

1. 盲肠结扎和穿刺 （CLP）

1. 从商业来源获得动物后，让它们在动物设施中适应至少 1 周，然后再进行 CLP（或假）手术。这将有助于最大限度地减少与运输相关的压力。
2. 将小鼠分组饲养，遵守当地的 IACUC 指南。
   注意:作为一般方向，动物被安置在每个笼子最多 5 只小鼠中，直到手术当天。使用宽 7.25 英寸、长 11.75 英寸、高 5 英寸的标准笼子，并配有玉米芯垫料。保持 12 小时:12 小时明暗循环，早上 7 点开灯，晚上 7 点关灯。外壳温度保持在 20-22 °C，相对湿度 （RH） 保持在 30% 至 60% 之间。确保 随意 获得标准的食物和水。
3. 为了进行 CLP，在诱导室中用异氟醚（2.5%，500 mL/min）麻醉动物。用镊子捏住爪子确认麻醉。一旦进入深度麻醉，如没有因捏爪子而反射性撤退所证实，使用鼻锥（2.5%，100-125 mL/min）将动物转移到持续麻醉。
   注意:在整个过程中应采用无菌技术。
4. 涂抹兽用眼润滑剂软膏，以保护动物的眼睛在手术过程中免受潜在的鼻锥引起的损伤或伤害。
5. 要清洁手术部位，请使用市售的脱毛剂。仅去除下腹部的毛皮，避免皮肤过度暴露。
   注意:或者，可以使用动物理发器，但必须小心避免皮肤损伤。
6. 暴露手术部位后，使用三次聚维酮碘（或等效的杀菌磨砂膏）清洁该区域，然后在每次使用之间用 70% 酒精冲洗。
7. 根据当地 IACUC 批准的镇痛治疗，给予单剂量 3.25 mg/kg 的缓释丁丙诺啡或等效物。
8. 将鼠标转移到手术区域。使用粘性铺巾隔离手术部位。在深度麻醉下，使用手术刀刀片在皮肤上做一个腹侧中线切口 （~2 cm）。
   1. 用剪刀将皮肤与肌肉层分开。使用手术刀刀片，在肌肉层上做一个较小的切口 （~1 cm）。一旦看到肠道，使用钝钳找到盲肠并将其外部取出。
9. 外出后，使用无菌 5-0 聚乳糖素可吸收缝合线结扎盲肠。考虑结扎的盲肠面积，定义为从盲肠远端到结扎点的距离，因为它会影响感染的严重程度。为了重现此处介绍的结果，请将盲肠从其远端点系 1 厘米。
   注意:结扎较大的盲肠区域将导致严重程度增加¹⁰。
10. 使用 27 G 针头，将盲肠贯穿，让粪便内容物泄漏。小心地轻轻挤压盲肠以使粪便内容物外化。要进行假手术，请按照暴露动物盲肠的相同步骤进行操作。但是，不要结扎或刺穿盲肠。
    注意:针规直接影响感染的严重程度。为了产生低度感染，建议使用 26 G 至 28 G 针头。请注意，使用较粗的针规会导致死亡率增加，并且动物可能无法忍受该方案随后的后肢悬吊阶段。
11. 将盲肠重新定位到腹腔中。用无菌的 5-0 可吸收缝合线闭合肌肉层。用 5-0 尼龙、不可吸收的缝合线缝合皮肤。皮肤缝合完成后， 通过 皮下注射在动物背部提供无菌盐水（雄性 1 mL，雌性 0.5 mL）。
    注意:为了闭合肌肉层，建议使用连续缝合技术，而对于皮肤层，建议使用间断缝合技术。查阅并遵守您当地的 IACUC 关于存活手术缝合的指南。
12. 手术后，将动物单独饲养在加热床垫或设置为 35 °C 的加热垫顶部的干净笼子中。 在麻醉恢复后的最初一小时内每 15 分钟观察一次鼠标，之后可以将其送回住房设施。
    注意:在笼子地板上提供最少量的食物，以允许动物 随意 进食，而不会影响手术部位。返回设施后，在化粪池动物评估后（第 3 步），每天检查动物两次。
13. 在接下来的 4 天内提供无菌生理盐水和镇痛支持，以使手术切口愈合。
    注意:每天监测剑突表面温度和体重有助于准确记录败血症严重程度¹¹。

2. 后肢悬吊 （HLS）

1. 要执行 HLS，研究人员必须遵循当地的 IACUC 道德准则。这包括确保使用适当的笼子尺寸和地板，这是在 HLS 条件下适应动物运动、饮食习惯的关键方面。
   注意:建议 CLP 后 4 天恢复以进行伤口愈合。
2. 从 CLP 或假手术中恢复 4 天后，在轻异氟醚流（2.5%，100-125 mL/min）下麻醉动物。使用泡沫胶带将鼠标尾巴连接到短金属链上。将金属链与尾巴平行放置，同时泡沫胶带将尾巴和链条牢牢地包裹在一起。
3. 为确保后肢的悬空，请将金属链连接到沿笼子中心连接到横杆的钩子上。此外，安装第二个可以沿着横杆移动的小杆，以便为动物提供更大的移动能力。
   注意:动物必须能够利用笼子地板上的金属网格通过前肢移动。
4. 调整悬挂肢体的高度，以防止爪子与食物颗粒接触。在暂停期间，每天至少两次用浸有水的棉签监测动物并用手清洁缝合皮肤周围的剃须区域。
   注意:清洁对于避免手术部位感染至关重要，尤其是由于身体姿势升高而导致的尿液烫伤。
5. 为了重现结果，请确保动物接受 7 天的后肢悬吊。持续时间是根据以前的时程研究确定的，该研究显示后肢悬吊在非脓毒症条件下对骨骼肌产生有意义的影响所需的最短时间^12,13。
   注意:动物的存活、不适或痛苦将根据感染的严重程度而增加。

3. 化粪池动物评估

注意:评估动物的临床状况是跟踪 CLP/假手术后严重程度的一个关键方面。此外，根据 IACUC 的要求，必须为动物福利建立人道终点。为了解决这些问题并为日常动物护理提供标准，使用了使用改良小鼠脓毒症评分 （MMSS） 进行动物评估的指导¹⁴。

1. 使用 MMSS（补充文件 1）评估动物。请注意，对于每个类别，分数 0 表示健康的动物。根据感染的严重程度，每天两次从 0 到 3 对动物进行评分。
2. 为了提高准确性，每天测量剑突表面温度和体重两次^{11,15 并与} MMSS 评分表一起记录。
   注意: 补充图 1 中提供了典型的剑突表面温度和体重波动。
3. 请咨询当地的 IACUC 以获取人道端点。
   注意:为了重现结果，使用以下标准作为终点:（1） 体重减轻 > 基线 40%。（2） 温度 <30 °C 或比以前的值降低 >5 °C。（3） 以下得分为 3:对刺激的反应、意识水平或呼吸质量。（4） 每日总 MSSS ≥17。此处描述的评估旨在在手术后和正常行走的动物中进行。建议避免处理接受 HLS 的动物，以防止其后肢与表面接触。最终评估后，根据当地动物伦理委员会的建议对动物实施安乐死。

结果

对于结果中显示的代表性数据，使用了 17 周龄的雄性 C57BL/6J 小鼠，体重范围为 27 至 34 克。整个方案需要 11 天才能完成，包括手术干预（CLP 或假手术）、生理盐水和镇痛支持（第 0 至 4 天）以及 HLS 废用（第 4 至 11 天）。终末实验可以在悬浮阶段的任何时间点进行。为了更好地了解该模型对骨骼肌功能的影响，结果是根据我们实验室完成的几项实验汇编而成的。将该方...

讨论

目前的方案为实施脓毒症诱发的肌病的新临床前模型提供了技术指南。详细描述了模型复制的所有材料和重要步骤。这种方法可以重现在脓毒症患者中观察到的骨骼肌功能障碍，突出了废用作为肌病恶化的关键组成部分的作用。到目前为止，大多数针对脓毒症诱导的肌病的临床前研究并未将废弃作为其病理生理学的活性成分 ^7,8,16,17...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Ethicon Coated Vicryl	Ethicon	D5792	Absorbable suture used for closure of muscle layer and for ligation of the cecum.
4-0 Ethilon Black 18"	Ethicon	662G	Non absorbable suture for closure of the skin layer.
BD  PrecisionGlide Needle 26-28 G	BD	305136 for 27g needle	Needle for puncturing the cecum.
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	strain #000664
Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991	Swabs for topical application of iodine.
Cryostat	(Leica CM1950)
Dynarex Povidone Iodine Prep Solution	Dynarex	1415	Topical Antiseptic Liquid for Skin and Mucosa
Ethanol 200 Proof (100%)	Fisher Scientific		To make 70% ethanol for cleaning skin.
Hindlimb Suspension Cages	Custom Made	N/A	These custom made cages will be highlighted in the video recordings of the MS.
Optixcare Eye Lube	Optixcare		Eye lube for protection during survival surgery.
Scalpel blades #11	Fine Science		Blade used to make incisions on skin and muscle.
Skin-Trac	Zimmer	736579	Foam tape for fixing the tail to the suspension apparatus.
SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer	Kent Scientific Corporation	SS-01	Vaporizer for Isoflurane Anesthesia
Tissue bath apparatus	Aurora Scientific	Model 800A, Dual Mode Muscle Lever 300C