用于确定狨猴卵巢周期阶段的血液采样和激素测量

摘要

该方案描述了用于测量孕酮/雌二醇和绒毛膜促性腺激素水平以确定卵巢周期阶段的血液和尿液采样。激素水平用于预测和确定排卵的时间，并注射激素以调节卵巢周期和卵母细胞生长。

摘要

普通狨猴是新大陆的小型猴子。由于狨猴的许多生物机制与人类相似，因此它们可能可用于神经科学、再生医学和发育等一系列领域的医学和人类生物学研究。然而，缺乏描述许多基本实验和程序方法的文献。这里描述了测定狨猴性激素（黄体酮、雌二醇和绒毛膜促性腺激素）水平的详细方法。这些激素的测量可以预测卵巢周期的阶段，狨猴通常为 26-30 天;准确测定对于在正确的时间点收获卵母细胞/受精卵以及为生成转基因狨猴准备宿主雌性至关重要。

此外，性激素水平的测量可用于内分泌学、行为学、早期发育和生殖生物学研究。该方案详细描述了从股静脉采血、分离血浆用于激素测量、使用尿液和血浆测量绒毛膜促性腺激素水平、使用注射前列腺素 F2α 类似物重置卵巢周期以缩短和同步周期，以及通过注射促卵泡激素和绒毛膜促性腺激素促进卵泡生长和排卵的方法。使用这些方案，可以确定卵巢周期的阶段，以便及时收集卵母细胞/受精卵。

引言

普通狨猴 （Callithrix jacchus） 是一种小型新大陆猴子，具有许多与人类相似的特征，其卵巢周期的持续时间为 26-30 天 ^1,2。对转基因狨猴的早期发育和生成的研究需要在卵巢周期的特定阶段收获卵母细胞和受精卵。因此，准确确定分期至关重要，可以通过测量激素黄体酮 （P4） 和雌二醇 （E2） 的血液水平来估计^2,3。这些激素促进子宫内膜生长，这是植入所必需的。P4 由黄体产生，黄体在排卵后立即在卵巢中形成。E2 由卵巢卵泡分泌，以响应大脑中下丘脑-垂体复合体的促卵泡激素 （FSH）。E2 水平随着卵泡的成熟而增加，在排卵前达到峰值³。高 E2 水平导致人类通过下丘脑-垂体复合体脉冲释放黄体生成素 （LH）;这种 LH 激增会诱导排卵。然而，在狨猴中，LH 基因在进化过程中发生了退化，排卵是由垂体释放绒毛膜促性腺激素 （CG） 诱导的，该蛋白的结构与 LH 相似 ^4,5。

卵巢周期可以通过激素注射来控制。人类 FSH 注射剂作用于卵巢 FSH 受体，用于促进雌激素合成和卵泡生长⁶。在卵泡期结束时注射人 CG （hCG） 作为 LH 的替代品，用于刺激人类排卵⁷。CG 注射也用于治疗人类不育症，因为 CG 会在怀孕早期刺激黄体，导致 P4 产生增加。前列腺素 F2α （PGF2α） 注射可重置卵巢周期⁸。在家牛中，PGF2α 注射用于缩短黄体期并同步发情周期以进行繁殖管理。

尽管狨猴和人类具有相似的生物机制，使它们成为理想的模式动物，但缺乏描述许多常用技术的基本方法的文献。采血是最常用的技术之一 ^9,10,11,12。然而，初学者有时很难找到静脉。因此，本研究对股静脉区域进行了解剖分析。根据解剖观察，该方案将股骨三角的近端区域引入静脉穿刺的简单部位。

研究方案

所有涉及狨猴的方法都采用了高道德和福利标准，并得到了国家儿童健康与发展中心的机构动物护理和使用委员会的批准。这里使用的动物是单舍或双舍（一雌一雄），每天光照 12 小时。

1. 股静脉采血

1. 准备一个 1 mL 注射器（短型易于使用），刀片面朝上连接 25 G 针头。为避免血液堵塞，将 200 μL 未稀释的肝素钠溶液吸入注射器中，使注射器肝素化。上下拉动数次，均匀涂布注射器内部;然后，从注射器中排出肝素溶液。
   注意:由于通常需要更换新的注射器，因此请准备一些额外的肝素化注射器。
2. 准备吸水棉签和酒精棉签。打开可调节灯，照亮将放置狨猴进行血液采样的区域。
3. 准备市售的约束装置（420 x 85 x 85 毫米， 图 1A）（有关详细信息 ，请参阅材料表 ）。要将狨猴放入设备中，请用海绵带打开固定部分，以固定狨猴。将狨猴面朝上插入约束装置中。
   注意:狨猴通常在约束装置中很平静，这可能不需要约束、适应或训练。
4. 捕捉狨猴;将狨猴插入圆柱形部分;然后按下海绵带将其固定。将要采集血液的腿放在另一条腿上（图 1A）。用非惯用手握住双腿;将中指和无名指放在每条腿内侧以固定它们，将其他手指放在每条腿外侧以固定它们。
   注意:捕捉狨猴时，建议使用咬合手套。如果没有约束装置，请在麻醉下或与另一个约束狨猴的人一起进行血液采集。
5. 检查大腿根部附近是否可见股静脉。如果没有，请触诊找到搏动的动脉并将其用作标志，以检查静脉是否在其内部运行（图 1B-D）。
   注意:建议使用桌面照明和剃须以提高能见度。用酒精棉签摩擦也可以提高能见度。三角形中的淋巴结通常位于静脉附近，并显示为深蓝色的静脉。如何区分它们 在 Representative Results 部分。
6. 使用酒精棉签对穿刺部位进行消毒。以 15°-20° 的角度插入针片面朝上。为防止针头在采血过程中从血管中滑出，请稳定握住注射器的手，例如，将注射器放在另一只手上。
7. 轻轻拉回柱塞以施加负压（图 1E）。向前推动针尖。血液进入注射器后，保持针尖的位置，直到收集到所需的体积 （500-700 μL）。
   1. 当血液没有进入注射器时，改变穿刺部位。如果拔针时有血流出，请对穿刺部位施加压力 3 分钟以止血。止血后，重新开始静脉穿刺。
   2. 如果抽入注射器的血液在抽吸过程中停止流动，请慢慢向前推动针尖，然后将其向后拉以找到血管。这可能会恢复流入注射器的血液。如果没有，请拔出针头并使用新注射器进行静脉穿刺。
      注意:当难以从同一侧采集血液时，使用另一条腿的大腿。
8. 小心地拔出针头，同时用小指轻轻按压穿刺部位。然后，使用吸水棉签，立即对穿刺部位施加压力 3 分钟以止血。倒置注射器以混合血液和肝素。
   注意:抽取动脉血时，在冷却时施加较长时间的压力（5 分钟），并仔细确认出血的头部，以防止形成血肿，血肿有时会导致致命的后果。
9. 确认出血已停止后，取下海绵带，用一只手握住动物的腰部，然后旋转动物，以便可以用另一只手从背部握住动物的腋下。
10. 将狨猴放回笼子里。为了减轻压力并促进重复采血，请为狨猴提供它最喜欢的食物（例如饼干、棉花糖或海绵蛋糕）。偶尔检查血肿的发生情况。
    注意:当早期发现血肿时，请使用压力绷带以防止血肿进展。当长时间后发现时，可能需要手术切除血肿并结扎股动脉并输血 ^9,13。
11. 从注射器上拆下针头以防止溶血。然后，沿着 1.5 mL 微管的内壁缓慢排出收集的血液。
    注意:在血浆分离之前，收集的血液可以在 4 ^°C 下储存长达 24 小时，以测量 P4/E2 水平。

2. 血浆分离和激素水平测定

1. 将血液放入 1.5 mL 管中，在 4 ^°C 下以 1,100 × g 离心 5 分钟。
2. 将分离的血浆（上清液）从 1.5 mL 试管转移到新的试管/杯中，小心避免包含血细胞（沉淀物）。
3. 使用 ELISA 试剂盒或自动分析仪测量 P4 和 E2 水平。如果血浆量不足以用于自动分析仪，请使用样品稀释溶液。
   注:对于使用自动分析仪的测量，仅需要 >175 μL 血浆即可测定 P4 水平，>250 μL 血浆即可测定 P4 和 E2。

3. 尿 CG 测量以检测排卵和怀孕

注意:狨猴的 CG 水平可以使用免疫层析试剂盒测试来测量排卵和怀孕。在排卵的情况下，可以在排卵前 0-2 天获得阳性结果。在怀孕的情况下，从怀孕的第 15-20 天到大约 100 天检测到阳性结果。该测试需要少量 （90 μL） 尿液（一滴尿液为 ~30 μL）。

1. 托盘法:如果同一个笼子里有两只以上的动物，请在前一天将目标狨猴（或其他动物）移动到另一个笼子里。在照明前一晚或之前将干净的托盘放在笼子底部。夜间尿液没有从膀胱中排出。因此，尿液通常在点燃后不久从膀胱中排出。
   注意:早上在照明前进入房间可能会打乱该群组的睡眠周期。通常可以在点燃后约 30 分钟内收集尿液。
2. 挤压方法:准备清洗过的托盘以收集尿液。找到狨猴的膀胱后，用手指的整个长度从正面和两侧小心地挤压它（图 1F）。在早上点亮房间之前收集尿液。
   注意:如果由于膀胱中没有尿液而导致尿液收集不成功，请稍等片刻，然后再试一次。小心不要过度用力，因为这会伤害动物。
3. 采集后，立即将尿液样品放入免疫层析检测试剂盒的孔中。根据制造商的说明，10 分钟后读取结果。

4. 控制和测定收集卵母细胞、受精卵和胚胎的卵巢周期阶段

1. 从卵巢收集生发囊泡 （GV） 卵母细胞
   1. 肌肉注射 3 μL 0.263 mg/mL 氯前列醇（一种合成的 PGF2α 类似物），稀释在 150 μL 生理盐水¹⁴ 中（图 2），以重置黄体期结束时的卵巢周期（即黄体期开始后 ≥10 天）。
      注:将稀释的溶液制备成更大体积可能很方便，因为稀释的氯前列醇在 +4 °C 下至少可保持稳定数周。
   2. 第二天（第 1 天），通过检查 P4 水平是否已下降来确认卵泡期的开始。
      注意:据报道，氯前列醇注射液可在 24 小时内显着降低 P4 水平（通常为 <10 ng/mL）³。
   3. 从第 1 天开始，每 2 天注射一次 FSH（25 IU，肌肉注射），总共 5 次（第 1、3、5、7 和 9 天）。第 10 天，下午注射 hCG （75 IU，肌肉注射）。
   4. 根据文献^15,16，在麻醉下通过卵泡抽吸在第 11 天从卵巢中收集 GV。
      注意:有时，排卵发生得比预期的要早。因此，建议从第 8 天开始检查 CG 水平。如果 CG 测试呈阳性，请在当天进行 GV 采集。
2. 中期 II （MII） 卵母细胞、受精卵和早期胚胎的收集
   1. 如步骤 4.1.1 中所述，使用氯前列醇重置卵巢周期。
   2. 第二天（第 1 天），通过检查 P4 水平是否已下降来确认卵泡期的开始。
   3. 为了收集受精卵和胚胎，从第 6 天开始将雌性狨猴与雄性狨猴一起饲养进行交配。
   4. 从第 7 天开始，检查女性的血液 P4/E2 水平和尿液 CG 水平。检测到 CG 是几天内（通常是第二天）排卵的迹象。与 P4 水平相比，P4 水平增加且 E2 水平降低的那一天，从输卵管^17,18 中收集 MII 卵母细胞或胚胎第 0 天 （E0） 受精卵。
   5. 对于胚胎收集，如文献中所述，根据目标阶段，在适当的时间点从输卵管（E1-E3,1-8 个细胞）^17,18 或子宫（E5-E10,8 个细胞-囊胚）19,20,21,22 进行冲洗。

结果

表 1 列出了与本研究中使用的动物相关的详细信息。

股静脉的解剖学分析
使用接受安乐死的 2 岁雄性普通狨猴 （I 7713M） 进行股静脉解剖分析。股静脉和动脉位于股骨三角中。股骨三角形形成于腹壁和大腿肌肉之间的边界处（图 1B-D）。在大腿根部，一条大静脉穿过倒三角?...

讨论

定位静脉是采血中最关键的步骤。根据解剖观察，该方案将股骨三角的近端区域引入狨猴中作为采血的简单部位。使用这个区域，可以很容易地从大静脉进行血液采样。然而，即使使用这种方案，有时也会发生动脉损伤。当动脉受伤时，建议通过施加压力 >5 分钟来完全止血，以防止血肿。此外，在施加压力的同时，使用冰块冷却点状部位也很有效。血肿可以用肝素（例?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AIA-360	Tosoh Corporation	0019945	Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK DILUENT CONCENTRATE	Tosoh Corporation	0020956	Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK SUBSTRATE SET II	Tosoh Corporation	0020968	Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK WASH CONCENTRATE	Tosoh Corporation	0020955	Hormone measurement (P4/E2)
CMS-1	CLEA Japan		Marmoset food
Estrumate	MSD Animal Health		PGF2alpha analog (cloprostenol)
Gonal-f Subcutaneous Injection 150	Merck Biopharma Co., Ltd.		FSH
Gonatropin for intramuscular injection 1000	ASKA Pharmaceutical Co., Ltd.	872413	hCG
Heparin sodium injection solution 5,000 units/5 mL	Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.	224122458	Blood collection
Immunochromatographic Test Kit for Detection of Common Marmoset Chorionic Gonadotropin (Dual Checker)	CLEA Japan, Inc.		Determining CG level
Low-profile double-arm microscope illumination LPF-SD	SHIOKAZE GIKEN		Desk lamp for blood collection
Marmoset blood collection restraint device	JIC Japan	JM-1006	Blood collection http://www.jic-japan.jp/prd/marmoset/prd016.html email: vi@jic-japan.jp
Metacam 0.05%	Boehringer Ingelheim Animal Health Japan Co., Ltd.		Hematoma treatment
Sample Cup, 3 mL, PS, for Tosoh 360 and AIA-600 II, 1000/Bag	Globe Scientific	110913	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2	Tosoh Corporation	0025224	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 CALIBRATOR SET	Tosoh Corporation	0025324	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 SAMPLE DILUTING SOLUTION	Tosoh Corporation	0025524	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII	Tosoh Corporation	0025240	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII CALIBRATOR SET	Tosoh Corporation	0025340	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII SAMPLE DILUTING SOLUTION	Tosoh Corporation	0025540	Hormone measurement (P4/E2)
Syringe with 25 G (0.50 x 25 mm) needle	TERUMO	SS-01T2525	Blood collection
Tensolvet 5.000 I.E. gel.	Dechra Pharmaceuticals	14033492	Hematoma treatment
TOSOH MULTI-CONTROL SET	Tosoh Corporation	0015965	Hormone measurement (P4/E2)