使用预混和冻干试剂进行基于 CRISPR 的即时诊断

摘要

在这里，我们介绍了基于预混、冻干重组酶等温扩增和基于成簇规则间隔短回文重复序列 （CRISPR） 的反应的逐步制备，这些反应可用于检测传染病病原体的核酸生物标志物或其他感兴趣的遗传标志物。

摘要

通过基于成簇规则间隔短回文重复序列 （CRISPR） 的检测进行分子诊断，具有较高的诊断准确性和适用于即时护理环境的属性，例如快速获得结果的周转时间、方便简单的读数以及不需要复杂的仪器。然而，由于反应的成分众多，需要手动处理，因此在护理点进行反应可能很麻烦。在此，我们提供了一个循序渐进的优化方案，用于使用基于重组酶的等温扩增和基于 CRISPR 的试剂对疾病病原体和遗传标记物进行稳健检测，这些试剂被预混合，然后以易于储存和即用型的形式冷冻干燥。预混的冻干试剂可以再水化后立即使用，并保持高扩增和检测效率。我们还提供了一份故障排除指南，针对在制备和使用预混冻干试剂进行基于 CRISPR 的诊断时的常见问题，以使更广泛的诊断/基因检测社区更容易使用检测平台。

引言

基于 CRISPR 的核酸生物标志物检测诊断于 2017 年首次报道 1,2,3,4，^此后，已被美国食品和药物管理局 （FDA） 批准的检测证明为下一代诊断，特别是用于检测严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 （SARS-CoV-2） RNA，在多个国家 ^5,6,7,8.除了 2019 冠状病毒病 （COVID-19） 之外，这些技术已被证明可有效检测各种病毒和细菌 9,10,11,12,13、遗传病突变和缺失，并且可以用于检测蛋白质和小分子生物标志物 ^2,12.基于 CRISPR 的诊断通常将等温扩增方法（如重组酶聚合酶扩增 （RPA） 或环介导的等温扩增 （LAMP）^14,15）与基于 CRISPR 的检测相结合，使用 RNA 引导的 CRISPR 相关 （Cas） 酶，在靶标识别后具有"侧支"核酸内切酶活性³.等温扩增和基于 CRISPR 的检测的双重用途赋予了这些技术几个理想的属性，特别是接近金标准聚合酶链反应 （PCR） 的高诊断准确性，以及多重和检测小序列差异的能力，包括单核苷酸多态性 ^1,9。

然而，最准确的基于 CRISPR 的诊断版本包含多个组成部分和步骤，并且使用非专家或在护理点 （POC） 执行可能会很复杂。为了应对将基于 CRISPR 的高精度诊断的使用扩展到 POC 设置的挑战，我们开发了制备预混、冻干、基于重组酶的等温扩增和基于 CRISPR 的检测反应的方案，这些反应易于使用和储存⁷.这些方案应补充现有的基于 CRISPR 的诊断¹⁴ 的优秀方案，其中包含有关基于 CRISPR 的诊断⁷、设计指南¹ 以及使用替代等温扩增技术 2,14,15,16 和 Cas 酶¹² 所需的生化成分生产的其他信息.最终，我们希望基于 CRISPR 的诊断可以帮助在需要便携式和无仪器分析的环境中实现快速、廉价和灵敏的核酸检测 ^1,9,17。

我们在实验方案中主要结合使用 RPA 和基于 Cas13 的检测。RPA 在接近环境温度 （37-42 °C） 下运行，因此对能源和设备的要求较低。其他等温扩增反应需要更高的温度（LAMP，60-65 °C;链置换扩增 （SDA），60 °C;指数扩增反应 （EXPAR），55 °C;解旋酶依赖性扩增 （HDA），65 °C）²。与 LAMP 引物不同，RPA 引物的设计也不复杂，并且可以扩展到多重扩增 ^7,9,14。尽管在实践中很难使用 RPA 对两个靶标进行多重检测，但对于如何设计多重 RPA 引物以最大限度地减少干扰，有明确的指导方针¹⁸。

虽然残留污染仍然是两步工作流程中的一个大问题，但与 LAMP¹⁴ 的大连接扩增子相比，生成的 RPA 扩增子体积小，不太可能引起残留污染。RPA 引物可以根据标准指南¹⁴ 进行设计:它们通常为 25-35 个核苷酸长，熔解温度为 54 至 67 °C。 扩增子大小应小于 200 个碱基对。逆转录酶 （RT） 可以添加到 RPA 中以实现 RNA 扩增，在逆转录 RPA （RT-RPA） 中，通常少量添加另一种酶核糖核酸酶 H （RNase H） 以帮助解析得到的 RNA:DNA 杂交并促进扩增反应 ^5,19。为了允许 T7 转录以进行基于 Cas13 的检测，可以将 T7 RNA 聚合酶启动子放置在正向 RPA 引物的 5' 端。

从 RPA 生成扩增子后，可以使用 crRNA 编程的 Cas 酶对其进行检测。在可用于扩增子检测的各种 Cas 酶中，我们更喜欢靶向 RNA 的 Cas13 变体，因为它们具有高切割活性¹ 和充分表征的多核苷酸切割偏好 ^7,9，后者可用于多重检测。Cas13 的 crRNA 序列设计为与产生的 RNA 中的靶位点互补（反向互补），具有间隔区和直接重复 （DR） 序列。crRNA 序列和 RPA 引物不应重叠，以避免对脱靶扩增产物进行基于 Cas 的意外检测，这会增加背景和假阳性¹⁴。

基于 Cas 的检测依赖于不同的检测方式来监测报告核酸分子（基于 Cas13 的反应的 RNA 报告^基因）的切割^1,2,14。不同的检测方式包括比色法、电化学读数、荧光、测序读数和侧向层析试纸²。我们专注于给定各种荧光团和报告基因的荧光读数，例如花青素 5 （Cy5）、罗丹明 X （ROX） 和羧基荧光素 （FAM），它们可以使用单个蓝色 LED 光源有效激发，并通过酶标仪或实时热循环仪分析它们的荧光 ^7,14。此外，荧光读数易于设置，并允许连续监测，从而实现实时定量。使用 Cas 酶的多重 RPA 预扩增和基于 Cas13 的多重检测可以与多色荧光读数相结合，以同时检测多个遗传靶标 ^2,7。

在我们的方案中，我们首先通过将 RNA 样品添加到 RT-RPA 试剂的冻干形式中，用 RT-RPA 等温扩增 RNA（图 1）。在 RT-RPA 过程中，T7 启动子被添加到生成的双链 DNA 扩增子中。此后，RPA 产物被转移到基于 Cas13 的冻干检测中，该检测也包含 T7 RNA 聚合酶。该检测反应会将 DNA 扩增子转化为 RNA（通过 T7 RNA 聚合酶），可以用 crRNA 编程的 Cas13 轻松检测。靶标激活的 Cas13 将裂解报告分子以产生可检测的荧光信号 ^2,7,14。虽然这里的方案与 Leptotrichia wadei （LwaCas13a） 的检测有关，但它们可以扩展到使用正交 Cas13 和 Cas12 酶对多达四个靶标进行同时、多重检测 ^7,9。基于 RPA 和 Cas 的检测反应也可以合并到一个试管中，但会损失灵敏度¹⁴。

图 1:基于 CRISPR 的检测工作流程。 该工作流程说明了两个靶基因的检测。首先，用 RPA 等温扩增 DNA 靶标内的目标区域;检测 RNA 靶标时，可以通过逆转录 （RT-RPA） 进行反应。此后，T7 转录将 dsDNA 扩增子转化为 RNA，而 RNA 又被能够在靶标结合时引发侧支 RNase 活性的 Cas13-crRNA 复合物识别。淬灭荧光报告基因的切割产生荧光信号，这些信号可以使用酶标仪进行监测，通过 LED 透射仪进行可视化，或与实时热循环仪一起使用。缩写: CRISPR = 成簇的规则间隔短回文重复序列;RT = 逆转录;RPA = 重组酶聚合酶扩增;Cas = CRISPR 相关蛋白;LED = 发光二极管。 请单击此处查看此图的较大版本。

这里介绍的方案的主要特点是用于冻干的预混配方。预混合简化了反应使用并提高了重现性，但基于 RPA 和 Cas 的检测中的许多组分（尤其是逆转录）和一些不稳定的辅因子（如 ATP）在溶液中不稳定。因此，我们配制了预混溶液，使其可以冷冻干燥以便长期储存，并易于运输和部署^1,9,20。预混合的冻干试剂也有助于提高检测灵敏度，因为可以添加更高的样品量（因此，更高的 DNA/RNA 起始量）来重构反应¹⁰。在我们的配方中，我们主要使用海藻糖²¹ 作为冻干 RPA 和基于 Cas 的检测反应中的冷冻保护剂⁷。除了试剂保存外，海藻糖还通过提高酶稳定性 16,22,23,24 和降低 dsDNA 的熔解温度来促进反应 ²³。探索海藻糖以外的其他稳定剂 5,7,21,25,26 可能会为不同的使用场景产生更优化的配方。

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研究方案

1. 冻干 RT-RPA 预混试剂的制备

1. 设备准备
   1. 准备液氮杜瓦瓶或托盘，用于反应的速冻。用液氮填充杜瓦瓶或托盘。
   2. 冻干机
      1. 检查排废管和腔室内部是否有冷凝水;如果需要，请去除水。
      2. 用 RNase 去污溶液清洁腔室内部和 1.5 mL 微量离心管金属架，然后用 70% 乙醇清洁。
      3. 关闭腔室门和真空释放阀。
      4. 打开冷冻干燥机。
      5. 手动将搁板温度设置为 -30 °C。
   3. 分子生物学设备
      1. 使用 RNase 去污溶液清洁以下物品:移液器、移液器吸头架、涡旋混合器、离心下微型离心机和永久性标记物。
      2. 用自来水清洁以下内容，然后用清洁湿巾纸擦拭:用于微量离心管的塑料架和用于冰块的泡沫盒。
      3. 用 RNase 去污溶液和 70% 乙醇清洁，制备加热块（用于溶解/再溶解三甘氨酸溶液）。然后，打开它并将温度设置为 60 °C。
2. 预混 RPA 反应的制备
   注:该配方用于 10 次反应（使用 3 个 RPA 沉淀）。
   1. 使用前检查三甘氨酸溶液中是否有沉淀物。如果有沉淀物，请在 60 °C 下孵育并在使用前充分混合以溶解这些沉淀物。在添加其他热敏试剂之前，将三甘氨酸溶液冷却。
      注意:如果试管在室温下长时间放置，很容易形成沉淀物。
   2. 从冰箱中取出三个 RPA 颗粒条管;轻轻敲击试管，将其敲击实验室工作台，以去除白色颗粒。
   3. 将所有三个沉淀转移到 1.5 mL 微量离心管 A 中。
   4. 移液 25 μL 不含核酸酶的水冲洗条管中残留的 RPA 粉末，然后将冲洗液转移到新的 1.5 mL 微量离心管 B 中。
   5. 向预混液管 B 中加入 10 μL 0.57 M 三甘氨酸溶液和 10 μL 引物混合物（各 10 μM）。
   6. 涡旋混合管 B;然后旋转并将试管放在冰上。
   7. 将 28.4 μL 的 5x RPA 缓冲液（由 500 μL 的 50% （w/v） PEG20000、250 μL 的 1 M Tris pH 7.4 和 100 μL 的 100 mM 二硫苏糖醇 （DTT） 制备）到预混管 B 中，并通过强烈敲击或多次摇晃充分混合。
      注:我们以这种方式制备溶液，以帮助稀释/降低预混管中 PEG 的粘度，然后再添加所有物质以溶解 RPA 沉淀。
   8. 将步骤 1.2.3 中收集在管 A 中的沉淀转移到 Mastermix 管 B 中，然后将 Mastermix 管倒置数次以混合。观察溶液是否均匀和单相（看起来也会略微不透明），然后将试管放在冰上。
      注:如果混合不彻底，PEG 会导致溶液/悬浮液发生相分离。
   9. 向预混液管中加入 0.71 μL 200 单位/μL RT 和 2.84 μL 5 单位/μL RNase H。 轻轻 地上下敲击或倒置 mastermix 试管多次。旋转并将试管放在冰上。
      注:我们在早期步骤的大量混合后添加这些酶，因为 RT 和 RNase H 对混合引起的剪切敏感;添加 RT/RNase H 后不再涡旋。
   10. 将 8.4 μL 预混液分装到 10 个预冷的 1.5 mL 试管中，然后将试管置于冰上。为此，请将移液器吸头浸入 Mastermix 溶液中，然后缓慢稳定地将 Mastermix 溶液吸入吸头中，以防止形成气泡并确保准确的体积测量。将预混液溶液分配到预冷的 1.5 ml 试管中。
       注:根据我们的经验，以 8.4 μL 等分装物为例，预混液管中将剩余 ~1-2 μL 悬浮液。实验人员可以稍微调低等分体积，以确保所有 10 个反应都有足够的试剂。处理粘性溶液时，请使用正确的移液技术。
   11. 分装完成后，将试管放入浸没在液氮中的金属架中，以准备冻干。将试管浸入液氮中 5 分钟。
       注:由于冻干去除了多余的溶液，因此我们可以添加更多的 DNA/RNA 起始量，这有助于提高灵敏度。冻干预混 RPA 反应可在 -20 °C 下储存 8 个月。如果使用同一批次制备的 RPA 预混液进行给定实验，冻干有助于提高可重复性，因此制作更大的批次也有帮助。
3. 冻干
   1. 在冷冻干燥机上，检查收集器和架子温度。如有必要，请等待收集器温度达到 -75 ± 5 °C，搁板温度达到 -30 ± 1 °C。
   2. 用一张清洁擦纸盖住金属架上的敞开的管子，将金属架与敞开的管子一起放入冻干机架子中，然后关闭架子门。
   3. 选择 表 1 中所示的程序，然后按 start。二次干燥步骤 30 分钟后（20 °C，<0.1 mbar;通过将步骤时间设置为"无限"来无限保持温度），按下 停止 程序。
      注意:我们让试管在冷冻干燥机中加热，以防止水凝结。
   4. 打开真空释放阀释放压力，然后从搁架上取下机架。立即加盖试管并将冻干反应物储存在 -20 °C 下。
      注意:冻干的 RPA 和 CRISPR-Cas13a 预混反应可以在 -20 °C 下储存 8 个月。

2. 冻干 CRISPR-Cas13a 预混检测试剂的制备

注意: 按照步骤 1.1 进行设备准备。

1. CRISPR-Cas13a 预混反应制剂（10 次反应）
   1. 从储存中取出以下物品并置于冰上:10 μL LwaCas13a（内部生产 ^7,8,14）（2 mg/mL），Cas 储存缓冲液，10 ng/μL （225 nM） crRNA，25 mM rNTP，50 单位/μL T7 RNA 聚合酶，2 μM FAM 荧光报告基因。
   2. 通过将 148.8 μL Cas 储存缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4、0.6 M NaCl、5% 甘油、2 mM DTT）添加到 10 μL 2 mg/mL LwaCas13a 中，制备 126 μg/mL （900 nM） 的 LwaCas13a 工作溶液。
   3. 按如下方式制备 CRISPR-Cas13a 预混液反应:71 μL 不含 RNase 的水、20 μL 400 mM Tris pH 7.4、20 μL 60% （w/v） 海藻糖、10 μL 10 ng/μL （225 nM） crRNA（此处靶向 SARS-CoV-2 的 s 和 n 基因）、8 μL 100 mM rNTP 混合物（每个 25 mM）、6 μL 50 单位/μL T7 RNA 聚合酶、 25 μL 2 μM FAM 荧光报告基因和 10 μL 126 μg/mL （900 nM） LwaCas13a。通过倒置 mastermix 管充分混合;然后，向下旋转。
   4. 将 17 μL 预混液分装到 10 个 1.5 mL 试管中，置于冰上。将试管放在浸没在液氮中的架子上，让试管浸入液氮中 5 分钟。
2. 冻干
   1. 在冷冻干燥机上，检查收集器和搁板温度，并等待收集器温度达到 -75 ± 5 °C，搁板温度达到 -30 ± 1 °C。
   2. 将试管放入冷冻干燥机中。选择 表 1 中所示的程序，然后按 start。二次干燥步骤（25 °C，<0.1 mbar;通过将步骤时间设置为"无限"来无限保持温度）30 分钟后， 停止 程序。
   3. 打开真空释放阀释放压力，然后从架子上取下冻存架。立即加盖试管并将冻干反应物储存在 -20 °C 下。
      注:冻干的 RPA 和 CRISPR-Cas13a 预混试剂可在 -20 °C 下储存 8 个月。

3. RT-RPA 核酸扩增

注:为防止交叉污染，应将工作区和移液器分开进行预扩增、样品添加和后扩增。我们建议使用带滤芯的移液器吸头。

1. 在 42 °C 下预热热热振荡培养箱。
2. 将 1 μL 乙酸镁 （Mg（OAc）₂） 和乙酸钾 （KOAc） 溶液混合物（由 196 mM Mg（OAc）₂ 和 1.5 M KOAc 组成）添加到含有冻干预混 RT-RPA 沉淀（来自第 1 部分）的试管一侧。
   注:添加 Mg（OAc）₂ 和 KOAc 混合物的技巧:液滴应放置在试管的 1 mL 体积标记附近。在这里，液滴将清晰可见，并且不太可能因管道关闭或其他操作而丢失。扩增将在旋转后开始，以收集管底部的液滴。当一次处理多个反应时，可以同时启动扩增。
3. 通过添加 12.4 μL RNA 样品（或对照样品）重悬 RT-RPA 沉淀。
   注:添加顺序为阴性样品/阴性对照、待检测的 RNA/DNA、阳性样品/阳性对照。
4. 要引发 RT-RPA 反应，在室温下使用离心小离心机短暂离心步骤 3.2 和 3.3 中添加的溶液 3 秒。
5. 小心敲击试管混合，然后再次短暂旋转 3 秒。
6. 将反应物置于预热的加热块或热振荡培养箱中，在 42 °C 下孵育反应 60 分钟。
7. 反应结束后，取出反应管并将其置于冰上，然后进行 CRISPR-Cas 检测步骤（第 4 部分）。
   注:RPA 扩增产物可立即用于检测反应，也可在 4 °C 下储存数天或在 -20 °C 下储存数月。

4. CRISPR-Cas13 核酸检测

1. 打开荧光酶标仪，将加热温度设置并预热至 37 °C，然后选择 表 2 所示的程序。
2. 将 384 孔板置于冰上。
3. 通过添加 17 μL 8 mM 氯化镁溶液，重悬冻干的 CRISPR-Cas 预混检测反应物（来自第 2 部分）。小心敲击试管混合;然后短暂旋转 3 秒并将试管放在冰上。
4. 将 18 μL 重悬的反应混合物转移到冰上预冷的 384 孔板的每个孔中。
5. 向每个反应孔中加入 2 μL 第 3 节中制备的 RPA 产物。
6. 从冰中取出板，将其快速放入预热的荧光酶标仪中，然后按 开始。
   注:将 384 孔板置于冰上，以便在将 384 孔板转移到预热的荧光酶标仪中时同步反应起始。

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结果

我们重点介绍了 SARS-CoV-2 的 s 和 n 基因联合检测产生 FAM 荧光信号的动力学，以及如何使用这些信息来确定冻干预混反应制剂的最佳条件。在所有情况下，我们纳入了 C_t 值远在确定检测限 （LoD） （C_t ~31-33） 内的样品，以及 C_t 在 LoD （C_t ~35-37）⁷ 的样品，以便区分具有更好灵敏度的方案。

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讨论

该协议包含关键步骤。对于区域分离，建议使用单独的空间进行核酸提取、预混液制备（扩增前区域）、样品添加和扩增子检测（扩增后区域）。每个区域都应使用一组单独的工具和设备进行设置。不要将工具从一个区域带入另一个区域，尤其是从后扩增区域进入预扩增区域。清洁工作区域是必要的:应使用 RNase/DNase 去污溶液/3% Clorox，然后用 70% 乙醇或高压灭菌去离子水?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Betaine solution	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
DEPC-Treated water	Invitrogen	AM9915G
Dithiothreitol (DTT)	Merck	3870-25GM
EpiScript reverse transcriptase	Lucigen	ERT12925K
Gly-Gly-Gly	Sigma-Aldrich	SIA-50239-1G
LwaCas13a	Producing in-house		Strain name:Leptotrichia wadei, Abbreviation: Lwa, Protein name: LwaCas13a
Magnesium chloride solution, 1M	Sigma-Aldrich	M1028-10X1ML
NxGenT7 RNA polymerase	Lucigen	30223-2
Poly(ethylene glycol)	Sigma-Aldrich	81300-1KG
Potassium acetate solution, 5M	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
Riobnucleotide Solution Mix	NEB	N0466L
RNase H	NEB	M0297L
Sucrose	TCI	TCI-S0111-500G
Trehalose Dihydrate	Sigma-Aldrich	SIA-90210-50G
Trizma hydrochloride solution, 1M, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194-100ML
TwistAmp Basic kit	TwistDx	TABAS03KIT
Equipment
BluPAD Dual LED Blue/White light transilluminator	Bio-Helix	BP001CU
Dry Bath Dual Block	ELITE	4-2-EL-02-220	Model: EL-02
Fluorescence microplate reader	Tecan	30050303	Model: Infinite 200 Pro
Freeze dryer	LABCONCO	794001030	FreeZone Triad Benchtop Freeze Dryer
Microplate 384-well	Greiner	GDE0784076	F-Bottom, small volume, Hibase, Med. Binding, Black
Real-time thermal cycler (CFX Connect Real-Time PCR System)	Bio-Rad	185-5201	Model: CFX Connect Optics Module
Oligonucleotide
s-gene forward RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA
s-gene reverse RPA primer	IDT		TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG
n-gene forward RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG
n-gene reverse RPA primer	IDT		CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC
LwaCas13a-crRNA for the s gene	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
LwaCas13a-crRNA for the n gene	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGACUAAAACAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ reporter	IDT		56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R RPA primer	IDT		AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah	IDT		GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC