利用恒定气压对针头开口进行湿式坡口

摘要

该协议描述了气动系统的组装，用于在针坡口过程中将加压空气输送到针头。该协议进一步描述了创建锋利的显微注射针的斜面过程以及如何测量针头的相对开口尺寸。

摘要

显微注射针是将基因组修饰试剂、CRISPR 组分（向导 RNA、Cas9 蛋白和供体模板）和转座子系统组分（质粒和转座酶 mRNA）递送到发育中的昆虫胚胎中的关键工具。锋利的显微注射针在输送这些修饰剂时尤为重要，因为它们有助于最大限度地减少对被注射胚胎的损伤，从而与使用非斜面针头注射相比，提高这些胚胎的存活率。此外，针头的斜面产生的针头在针头之间更加一致，而不是通过刷尖端摩擦物体（盖玻片的侧面、要注射的胚胎表面等）来随机折断针尖而打开的针头。用输送到针头的恒压空气对显微注射针进行湿式斜切的过程使斜切针头的人可以知道针头何时打开（存在气泡），并且还可以相对指示针头开口的大小。针头中的相对开口尺寸可以通过调整输送到针头的气压来确定，直到达到平衡并且气泡停止从针尖流出。达到平衡的压力越低，针的尺寸就越大;相反，压力越高，针尺寸越小。

引言

昆虫基因改造是 Rubin 和 Spradling 最初在果蝇中开发的一个过程，多年来，这个过程已被修改以在其他物种中产生基因改造¹。该过程依赖于在发育中的胚胎内的特定时间和位置将修饰成分显微注射到胚胎中 ^2,3,4。锋利的显微注射针是某些昆虫（如蚊子^{4、5、6、7、8、9} 和沙蝇¹⁰）基因改造过程中的关键工具，而对其他昆虫（如蚕¹¹）则不那么重要。在尝试创造转基因昆虫时，锋利的针头通常是成功与失败的关键因素 ^2,4。通常，通过将玻璃加热到玻璃变得有弹性的程度来拉动微毛细管玻璃针，从而将毛细管拉入锥形封闭尖端针头中。在使用针头之前，需要以产生锋利注射尖端的方式打开针头。传统上，针头是通过用针尖轻轻刷碰某物（载玻片/盖玻片的边缘或胚胎等）来打开针头的，这会导致少量玻璃从针尖脱落，随机产生一个尖锐的尖端 ^2,3。一种稍微不那么随意的工艺是干式坡口，其中针头在短时间内快速下降到光学平坦的旋转磨料板上，导致少量玻璃从针尖磨损，从而形成锋利的尖端。干斜面比用针尖刷某物要少一些随机性。下面描述的方案将坡口加工过程更进一步，向被坡口的针头提供压缩空气，并将其倒角置于液体层下，以便在针头打开后立即看到气泡。该协议详细介绍了一种生产可靠锋利的显微注射针头的方法。在液体层下进行坡口比如上所述随机折断针头和改进干式坡口，因为用户会收到有关坡口过程的反馈，使坡口人员能够知道针何时打开以及针口的相对大小。知道针尖的相对开口尺寸可以让斜切的人制作具有不同开口尺寸的针。各种针口尺寸具有不同的优点;例如，较大的针头开口尺寸可以容纳高粘度的注射混合物，而较小的开口针头对被注射的胚胎造成的损伤较小。

使用调节器和基于改进的气压调节注射系统² 的氨基甲酸乙根管系统向针头供应空气。当空气以恒定压力供应到针头时，针头在一层液体下斜面。坡口加工过程由重复的五步过程组成：1） 将磨针降低到磨料表面，2） 让磨针短暂坡口，3） 将磨针从磨料板上抬起，同时保持其保持在液体层表面下方，4） 停止磨料板的旋转以检查气泡的出现。如果不存在气泡，则重复步骤 1 到 4，直到出现气泡;5） 一旦出现气泡，就可以调整气压以确定针头的相对开口尺寸。阻止气泡形成所需的压力越低，针尖的开口就越大。

研究方案

注：如下所述的方案使用 Sutter BV-10 微毛细管斜面。但是，可以修改该协议以用于任何型号的微毛细管斜面。

1. 调节器、压力表和供气管的组装

1. 剪下一段聚氨酯管，用于从气源到调节器底座 （R;第 1 节， 图 1）。该部分的长度将取决于从空气供应到位于坡口旁边的调节器的距离。
2. 将软管夹滑到聚氨酯管上，然后将软管接头推入管子的末端。将软管接头靠在坚硬的表面上，确保软管接头完全插入。将管路靠近软管接头，将管路用力压入软管，直到软管接头完全插入。软管夹和软管接头共同形成连接 HC（图 1）。
3. 将软管夹向上滑动到插入软管接头的管道末端。在插入的倒钩端上旋转软管夹，使其形成气密连接。
4. 用手将软管接头拧入调节器 （R） 的底座，然后用小扳手拧紧连接。确保连接是气密的，但不要过紧。
5. 在调节器的侧端口中，用手拧入 T 型连接器 （T），然后用小扳手完成拧紧。
6. 切割一小块氨基甲酸乙酯管（图 1，第 2 节），长度约为 3-5 厘米。将两个软管夹放在管子上，然后将软管接头插入管子的每一端，并按照步骤 1.2-1.4 中的说明完成管子每一端的连接 （HC）。
7. 将短管的一端拧入压力表的底部，然后按照步骤 1.5 中的扳手完成拧紧。
8. 将短管的另一端拧入步骤 1.5 中连接到稳压器的 T 连接器 （T） 上的一个端口中。
9. 剪下一段氨基甲酸乙酯管（图 1，第 3 节），用于调节器和持针器 （NH） 之间的连接。该部分的大小将取决于从坡口机到调节器位置的距离。
10. 将软管夹放在管道部分上，然后按照步骤 1.2-1.4 中的说明插入软管接头。
11. 在这部分管路的另一侧，放置针架 （NH） 随附的母鲁尔接头 （LC）。
12. 从机械手上拆下固定夹和尼龙垫圈（图 2，f）。固定夹和垫圈仅用于固定玻璃微毛细管，它们不是为了容纳微毛细管支架、螺纹杆和供气管的额外重量而设计的。
13. 剪下一块 1.5 厘米 x 2 厘米的矩形橡胶包装板，将螺纹杆包裹在自行车挡泥板夹中。这将有助于将螺纹杆和持针器更牢固地固定在自行车挡泥板夹中。使用两个尖嘴钳，打开自行车挡泥板夹，将矩形橡胶包装板折叠在螺纹杆上，距离杆一端 3.5 厘米，使其在杆上形成 U 形。将橡胶板覆盖的螺纹杆插入打开的自行车挡泥板夹中，然后用钳子关闭杆和橡胶板周围的夹子。将自行车夹和螺纹杆组件安装到机械手螺栓上，更换不含尼龙垫圈的固定夹，拧紧固定夹，直到它牢固地固定螺纹杆组件。
14. 将持针器拧到螺纹杆上。确保鲁尔接头末端在连接时不会束缚聚氨酯管的位置（图 2，g）。
15. 将母鲁尔连接器连接到持针器（图 2，d）的公鲁尔连接器（图 2，g）。
16. 将 图 1 第 1 节管的自由端连接到气源（此连接将根据所使用的气源而有所不同）。气源应清洁、干燥，无油渣。空气供应可以来自室内气源或气瓶，压缩空气或氮气。

2. 硼硅酸盐针头斜面

1. 使用硼硅酸盐玻璃微毛细管在仪器上使用以下设置拉动显微注射针：热量：305，Fil：4，Vel：70，Del：235，Pul：160，循环时间为 12.24。
2. 根据制造商的说明组装研磨组件，由磨料板和带磁铁¹² 的固定环组成。
   注意： 可能需要用一条薄薄的透明薄膜包裹磨料板，以防止 Photo-Flo（润湿剂）从磨料板上过早泄漏。只有当润湿剂溶液过早泄漏到基座油中，导致磨板停止旋转时，才需要这样做。润湿剂降低了斜切后玻璃针上出现干痕的风险。使用润湿剂对于坡口过程并不重要，可以用水代替。
3. 将 10 滴基座油滴在基座的光学平坦表面上，然后将研磨组件放在顶部。启动磨削组件。
4. 打开光源以照亮表面。确保光源位于斜面后面，并与磨料板和喷针成 45° 角照射。照明角度是必要的，以便很容易看到针的阴影。以 90 倍放大倍率，将显微镜头旋转到位。短暂停止磨盘旋转并将显微镜聚焦在磨盘表面。
5. 在灯芯中加入 1% 的润湿剂，直到灯芯完全湿润。在磨料板表面加入 1% 的润湿剂。确保润湿剂覆盖磨料表面，但不会泄漏到黑色固定环上。
6. 在研磨板旋转时，将预湿吸芯放在研磨板的表面上。确保灯芯位于砂轮板的左侧（从顶部向下看时）并从 11 点钟方向延伸到 6 点钟位置（以砂轮板作为钟面）。确保灯芯不会挂在固定环的黑色部分。
7. 将针头插入持针器（图 2，d）并拧紧固定环以将针头固定到位。打开调节器（图 1，R）并将压力增加到 24 psi。
8. 通过旋转航向调节旋钮升高针架（图 2，a）确保针头抬高到足以高于旋转磨盘表面的高度，然后旋转整个机械手，使针摆动到旋转磨盘上方的位置。应将要斜切的针放在旋转的磨板上，其方向应使板的旋转远离针尖（图 3A）
9. 从侧面观察，使用粗调旋钮（图 2，a）将针头降低到磨料板表面。当针头几乎接触液体表面时停止。
10. 使用变焦降低显微镜的放大倍率，然后移动显微镜，使针位于视野的中心。进入视图中心后，增加放大倍数，调整操纵器的位置，使针尖保持在视图中心。一旦达到最大放大倍率，停止研磨板并将显微镜聚焦在研磨板的表面，然后在表面聚焦后立即重新开始研磨板的旋转。此时可能看不到针。
11. 使用机械手粗调旋钮，将针头降低到磨料板上。在视野中，可以看到针的图像和针的阴影。当指针和指针的阴影接近接触时，切换到机械手微调旋钮并继续降低指针，直到指针及其阴影出现接触。此时，读取卡尺（图 2、c）并记下读数。砂盘表面等于或低于此卡尺读数。
    注意：当针头接触旋转砂盘的表面时很难看到，因此此时针头实际上可能没有接触砂轮。
12. 让针在此卡尺读数水平上保持 5-10 秒。
13. 使用机械手微调旋钮，抬起针头，确保它保持在润湿剂表面下方。停止研磨板的旋转几秒钟，观察气泡是否从针尖逸出。如果存在气泡，请继续执行步骤 2.15。如果不存在气泡，请继续执行步骤 2.14。
14. 使用机械手微调旋钮将针移回卡尺读数处，然后将其向下移动一点并获取新的卡尺读数，然后重复步骤 2.12-2.13。
15. 再次启动砂板，看看在砂板旋转时是否观察到气泡形成。如果在板旋转过程中可以看到气泡形成的证据，则针尖的开口可能太大，无法进行敏感的胚胎显微注射，例如蚊子胚胎注射。如果在磨料板旋转过程中看不到气泡形成，则针头开口非常适合用于需要尖锐和小开口针头的手术。
16. 使用机械手路线调节旋钮将针头升高到砂板上方足够高的位置，这样当整个机械手旋转以将针头从磨料板和显微镜上移开时，针头不会碰到任何东西。
17. 一旦针头处于可以取出而不会碰到任何东西的位置，将气压降低到零，取出针头，然后将其放入针头储存盒（带有双面胶带或造型粘土的培养皿，用于固定斜面针头）中直至使用。

3. 确定斜面针的相对开口尺寸

注意：确定斜面针的相对开口尺寸在步骤 2.13 中完成。以下步骤进一步描述了此过程。

1. 在步骤 2.13 中观察到气泡后，在磨料板不旋转的情况下，通过旋转调节器调节旋钮（图 1，R）缓慢降低气压，直到气泡停止从针尖流出。注意气泡停止从尖端流出的压力。
2. 增加气压，直到气泡再次从针尖流出。压力越高，针的开口越小。
3. 继续将针头移动到可以安全移除的位置步骤 2.16-2.17。

结果

上述程序可产生始终锋利的显微注射针头。锋利的针头的特点是能够插入柔软的绒毛膜昆虫胚胎，例如蚊子胚胎，而胚膜几乎没有阻力。当蚊子胚胎被显微注射进行基因改造时，胚胎膜相对有弹性。将钝针推向胚胎膜会导致其凹陷（图 4B）。当针头被拉回时，膜会恢复其形状。在足够的压力下，钝针最终会撕裂膜，胚质很可能会泄漏出来。针头越锋...

讨论

蚊子的基因改造依赖于将修饰材料（质粒、向导 RNA 或蛋白质）精确显微注射到胚层前胚胎中 3,4,5,6,7,8。这个过程的关键是锋利的针头，在注射过程中很容易刺穿胚胎 ^2,4。锋利的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mm O.D. microcapillaries	World Precision Instruments
Beveler pedestal oil	Sutter Instruments	008
Bicycle fender clip	VeloOrange	R-clip 4-pack	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Boom Stand Microscope	AmScope		AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope or equivalent
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
Diamond abrasive plate	Sutter Instruments	104F	Diamond abrasive plate - extra fine (0.2 µ to 1.0 µ tip sizes)
Gasket, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	Used to seal connection on T  or L connectors, if not already included with these pieces
Hose Clamp	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-pkg
Hose connector	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	Need 5 hose connectors
Microinjection Needle Holder	World Precision Instruments	MPH3-10	Needle holder for 1mm outer diameter microcapillaries
P-2000	Sutter Instruments		Any needle puller
Photo-Flo 200 Solution	B&H Photo, Video and Audio	BH #KOPF200P  MFR #1464510	wetting agent
Pressure Gauge	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	0-100 psi gauge
Reference wick	Sutter Instruments	X050300
Reference wick holder	Sutter Instruments	M100019
Regulator	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	Need #10-32 ports for connections
Rubber Packing Sheet 6 inx 6 in	Danco	Model # 59849
T fitting	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pkg
Threaded Bar			Either a threaded rod or bar with threaded end. Threads must be 10-32.
Urethane tubing	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	URH1-0804-BLT-050