用于人类心脏多尺度三维解剖学研究的管道

摘要

该协议提供了一个全面的管道，用于分析从人类心脏获得的样品，这些样品跨越微观和宏观尺度。

摘要

对排斥移植的未衰竭人类心脏的详细研究为在微观和宏观尺度上进行结构分析提供了独特的机会。这些技术包括组织透明化（对溶剂透明化器官进行改良免疫标记的三维 （3D） 成像）和免疫组织化学染色。中镜检查程序包括立体解剖和显微计算机断层扫描 （CT）。肉眼检查程序包括大体解剖、摄影（包括立体和摄影测量）、CT 和物理或虚拟解剖或整个心脏的 3D 打印。在肉眼检查之前，可以进行压力灌注固定以保持心脏的 3D 结构和生理相关形态。将这些技术相结合来研究人类心脏是独特且至关重要的，对于在心脏 3D 结构的背景下理解不同解剖特征（如冠状动脉系统和心肌神经支配）之间的关系至关重要。该协议详细描述了方法，并包括代表性结果，以说明人类心脏解剖学研究的进展。

引言

由于功能服从形式，了解心脏的结构是欣赏其生理学的基础。尽管大量研究揭示了从微观到宏观的心脏解剖结构 ^1,2,3，^但多个问题仍未解决，尤其是与人类心脏解剖学相关的问题。这部分是因为专注于功能解剖学的基础研究通常使用动物心脏 ^4,5,6，这通常与人类心脏 ^1,7,8 不同。此外，每项单独的研究，即使是那些使用人类心脏样本的研究，也往往侧重于非常具体的结构，这使得很难在整个心脏的背景下应用这些发现。如果聚焦结构位于微尺度或中尺度，例如 perinexus⁹ 和 ganglionated plexus¹⁰，则更是如此。

在这种情况下，对被拒绝移植的人类心脏的系统结构研究提供了一个独特而难得的机会，可以获得微观和宏观尺度上聚焦的心脏结构的综合图谱¹¹。显微镜检查方案包括组织透明化（溶剂透明化器官的改良免疫标记启用三维 （3D） 成像，iDISCO+）^{12,13 和免疫}组织化学染色。中镜检查方案包括立体解剖、宏摄影和显微计算机断层扫描 （CT）。肉眼检查方案包括大体解剖¹⁴、摄影（包括立体画和摄影测量）^15、16、17、CT、虚拟解剖¹⁸ 和物理或虚拟解剖或整个心脏的 3D 打印¹⁷。为了准备肉眼检查，进行压力灌注固定以保持心脏的 3D 结构和生理相关形态 14,19,20,21。这些技术的组合应用是独一无二的，对于在人体心脏的 3D 结构背景下关联不同的解剖特征至关重要。

由于获得非病理性人类心脏样本的机会极其有限，因此本文描述的多尺度方法可以最大限度地利用样本。通过应用下面描述的各种程序，具有代表性的结果将向读者说明如何将这些发现用于多种目的，包括科学研究¹¹ 中的发现（心脏神经支配的综合分析、神经节神经丛的分布）、临床程序的改进（手术和介入方法的模拟）和解剖学教育（心脏解剖学的真实 3D 演示）。

研究方案

这项研究使用了从非失败的供体人类心脏中收集的去识别化组织样本，并获得了加州大学洛杉矶分校 （UCLA） 机构审查委员会的批准。样本来自被拒绝移植的未衰竭心脏。对心脏进行压力灌注，用 4% 多聚甲醛 （PFA） 固定，并在组织处理前按照以下方法进行成像。 图 1 总结了研究顺序的流程图。材料 表中列出了研究中使用的试剂和设备的详细信息。

1. 微观检查

1. 使用改良免疫标记的溶剂透明化器官 3D 成像 （iDISCO+） 方案进行组织透明化。
   1. 用手术刀解剖 4% PFA 固定的组织，使其适合 3 mm × 16 mm × 25 mm 的共聚焦显微镜室。为了对较厚的组织进行成像，可以在载玻片上堆叠额外的腔室和/或垫片。
   2. 使用分级甲醇 （MeOH） 系列（20%、40%、60%、80% 和 100% MeOH 在去离子 H₂O [体积/体积]）下在室温 （RT） 下搅拌每个样品 1 小时。
   3. 在 RT 下用 100% MeOH 洗涤 1 小时，然后在 RT 下浸入 66% 二氯甲烷/33% MeOH 中搅拌过夜。
   4. 第二天，在 RT 下用 MeOH （100%） 洗涤两次 1 小时，在 4 °C 下冷却，并在 4 °C 下用 5% H₂O₂ 在 MeOH （vol/vol） 中处理过夜。
   5. 用分级的 MeOH 系列（80%、60%、40% 和 20% MeOH）再水化，并在 0.01 mol/L PBS 中洗涤 1 小时，每次在 RT 下搅拌。
   6. 在 RT 下，在 0.01 mol/L PBS 和 0.2% Triton X-100 中洗涤组织两次，持续 1 小时。
   7. 在 0.01 mol/L PBS、20% 二甲基亚砜 （DMSO）、0.2% Triton X-100 和 0.3 mol/L 甘氨酸中透化 2 天，在 37 °C 下搅拌，制备免疫标记。
   8. 在 0.01 mol/L PBS 中，含 10% DMSO、0.2% Triton X-100 和 5% 正常驴血清，在 37 °C 下搅拌再封闭 2 天。
   9. 使用与偶联荧光团的 MeOH 相容的一抗进行标记，该荧光团在 0.01 mol/L PBS 中稀释，其中含有 10 mg/mL 肝素 （PTwH）、0.2% 吐温-20、5% DMSO 和 3% 正常驴血清，在 37 °C 下搅拌 3-4 天。
   10. 补充抗体溶液，并在 37 °C 下搅拌再孵育 3-4 天。
   11. 在一抗溶液中孵育 1 周后，在 RT 下用 PTwH 洗涤 4 至 5 次过夜。
   12. 与在 PTwH、3% 正常驴血清中稀释的荧光团偶联的二抗在 37 °C 下搅拌孵育 3 天。
   13. 补充二抗溶液，在 37 °C 下搅拌再孵育 3 天。
   14. 在二抗溶液中孵育 6 天后，在 RT 下用 PTwH 洗涤 4-5 次过夜。
   15. 用分级的 MeOH 系列（20%、40%、60%、80%、100% 和 100% MeOH）脱水。样品可以在 RT 中储存过夜。
   16. 在 RT 下在 66% 二氯甲烷/33% MeOH 中孵育 3 小时，同时搅拌。
   17. 在 RT 下用 100% 二氯甲烷洗涤两次，每次 15 分钟，并搅拌。
   18. 将标本孵育并储存在苄基醚中。填充试管以尽量减少空气氧化样品。
2. 对组织透明化标本进行成像
   1. 将含有粘合剂的腔室固定在载玻片上，并在腔室周边涂抹指甲油。对于较厚的组织，可以在载玻片上堆叠额外的腔室和/或垫片。
   2. 将透明化的组织放入腔室中，填充苄醚，并盖上盖玻片。
   3. 在盖玻片周围涂上指甲油以形成密封。
   4. 使用带有 5 倍或 10 倍镜头的正置激光扫描共聚焦显微镜获取 tilescan 和 Z 堆栈图像，以在镜头工作距离的深度成像。
   5. 使用适用于所用荧光团发射光谱的激光线以 1024 x 1024 的分辨率成像。使用 488 nm 激光线可以看到肌肉自发荧光。
   6. 确保 z 轴步长与基于指定物镜¹¹ 的数值孔径的奈奎斯特采样相称。
   7. 拼接图像并使用软件进行 3D 可视化。
   8. 使用单个和合并通道的 Z 堆栈的最大强度投影 （MIP） 图像创建图形（图 2）。
3. 免疫组化
   注:在组织石蜡包埋²² 后，使用以下程序创建用于免疫组织化学研究的载玻片。
   1. 制备折射率匹配溶液 （RIMS）。
      1. 向去离子 H₂O 中加入 10.9 g Na₂HPO₄（无水）和 3.1 g NaH₂PO₄（一水合物），制备 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液，总体积为 1 L （pH 7.4）。过滤消毒溶液并将其储存在 RT 中。
      2. 将磷酸盐缓冲液稀释至 0.02 mol/L。
      3. 用磁力搅拌棒在最终储存瓶中搅拌溶液 10 分钟，将 Histodenz 溶解在 30 mL 0.02 mol/L 磷酸盐缓冲液中，该储存瓶可以密封以最大限度地减少蒸发和污染。
      4. 加入叠氮化钠至总浓度为 0.01% （w/v），并用 NaOH 将 pH 值调节至 7.5。
      5. 通过改变 Histodenz 的最终浓度来调整 RI。
      6. 将 RIMS 在 RT 中存放数月。如果发现微生物污染，请丢弃。
         注意:请勿高压灭菌任何含有叠氮化钠的溶液。
   2. 制备用于免疫组织化学研究的载玻片
      1. 用切片机创建 5 μm 厚的切片。将组织切片应用于带电的载玻片。
      2. 通过将载玻片在 >75% 二甲苯中孵育 10 分钟来去除石蜡。将玻片移至装有二甲苯的第二个容器中再放置 10 分钟。
      3. 将载玻片浸入 100% 乙醇中 10 分钟，然后在 95% 乙醇中浸泡 5 分钟，在 70% 乙醇中浸泡 5 分钟，去除二甲苯。
      4. 用去离子 H₂O 冲洗载玻片 5 分钟。
      5. 将玻片在 90-95^°C 下浸入抗原修复缓冲液中 25 分钟。
      6. 让容器在搅拌下冷却至 RT 1 小时。
      7. 将载玻片浸入浸泡缓冲液 （0.01 mol/L PBS + 0.4% Triton X-100） 中，在 4^°C 下浸泡 30 分钟。
      8. 用 PAP 笔圈住组织。将 PBS 添加到每张载玻片中，并将其放入加湿室中以防止干燥。
      9. 在 RT 下用 PBS 洗涤载玻片，搅拌 5 分钟。
      10. 用封闭缓冲液（0.01 mol/L PBS + 10% 驴血清 + 0.1% TX-100）封闭 1 小时，同时搅拌。
      11. 与在封闭缓冲液中稀释的一抗在 4^°C 下孵育过夜。
      12. 第二天，让载玻片升温至 RT 15 分钟。
      13. 用 0.01 mol/L PBS + 0.2% TritonX-100 洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟。
      14. 与在封闭缓冲液中稀释的二抗在 RT 下搅拌孵育 1 小时。
      15. 用 0.01 mol/L PBS + 0.2% TritonX-100 洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟。
      16. 用 0.01 mol/L PBS 洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟。
      17. 用滴管滴入 1 滴 RIMS 并盖上盖玻片。
      18. 在盖玻片周围涂上指甲油以形成密封。
      19. 作为阴性对照，在没有一抗的情况下运行样品，以证明不存在特异性染色。
   3. 免疫染色玻片成像
      1. 使用带有 10 倍、20 倍和 40 倍物镜的激光扫描共聚焦显微镜对载玻片进行成像。
      2. 使用适合所用二抗发射光谱的激光线以 1024 x 1024 的分辨率成像。
      3. 使用单个和合并通道的 Z 堆栈的最大强度投影 （MIP） 图像创建图形（图 3）。

2. 中尺度检查

1. 立体解剖
   1. 使用带夹的放大台灯、手术望远镜或体视显微镜，对微小或薄的结构进行精细解剖，例如房室结、房室结动脉和心脏神经丛（亚毫米到毫米级）。
2. 显微 CT 扫描
   注意:在压力灌注和固定后以及使用微正电子发射断层扫描 （PET）/CT 扫描仪在解剖的任何阶段进行 CT 成像（图 4）。
   1. 在样品成像之前，将 CT X 射线源预热 25 分钟。
   2. 将心脏样本放在扫描仪床上。
   3. 将扫描仪床移动到 544 mm 的水平位置和 14 mm 的垂直位置，以使心脏在 CT 视野 （FOV） 中居中。
   4. 以 80 kVp、150 μA 的速度获取 CT 图像，在 1 分钟的扫描时间内以 200 μm 的空间分辨率进行 720 次投影。
   5. 使用 12 厘米 x 12 厘米 x 10 厘米的视野和 600 x 600 x 500 体素的矩阵重建 CT 数据，并另存为 DICOM 文件。

3. 宏观考察

1. 加压灌注和固定
   注:作者修改了先前描述的压力灌注和固定技术，并将其应用于拒绝移植的非失败人类心脏 14,19,20,21。
   1. 使用高流量泵进行灌注固定。使用 100% 乙醇¹⁴、4% PFA 或 10% 福尔马林作为固定剂。
      注意:通过尽可能远端切除升主动脉、肺干、腔静脉和肺静脉来恢复心脏，并在威斯康星大学解决方案²³ 中输送。
   2. 使用两个 20-24 Fr 手术插管进行右心和左心灌注。对于右心灌注，插管上腔静脉，并用半切 12-30 mL 大小的塑料注射器在肺干或肺动脉处放置一个通气口，该注射器带有连接到三通旋塞阀的 Luer-Lock 尖端。
   3. 放入适当大小的锁定半切塑料注射器或 1.5-5.0 mL 离心管后，用麻线封闭下腔静脉和另一条肺动脉。
      1. 对于左心的顺行灌注，将其中一条肺静脉插管，并使用半切 12-30 mL 大小的塑料注射器在主动脉的远端放置一个通风口，该注射器带有连接到三通旋塞阀的 Luer-Lock 尖端。
      2. 对于左心的逆行灌注，将其中一个主动脉弓分支插管，并在主动脉弓的另一个分支处放置一个通风口。将插管的尖端放在两个心室中。
   4. 插入适当大小的锁定半切塑料注射器或 1.5-5.0 mL 微量离心管后，用麻线堵塞其他血管孔。用薄纱布盖住注射器/管子/插管的插入部分，以防止渗漏和滑落。使用缝合、绑扎或结块修复大渗漏。允许少量泄漏。
   5. 将心脏悬在塑料容器中。
   6. 将 22-24 Fr 软塑料管连接到每个套管上，并将管子的另一端插入装满固定剂的容器中。
   7. 使用高流量泵在右心和左心回路中循环固定剂，右心和左心分别达到约 100-300 mL/min 和 200-400 mL/min，分别在右心室达到约 20 mmHg 和左心室约 80 mmHg。
   8. 在 4 °C 维持灌注 24 小时。
   9. 用 0.01 mol/L PBS 洗涤心脏 30 分钟，搅拌 4 次。
   10. 将心脏储存在 4 °C 的 0.01 mol/L PBS/0.02% 叠氮化钠中。
       注意:压力灌注固定仅对新鲜心脏有效，对从防腐尸体中恢复的心脏无效。
2. 大体解剖
   1. 在解剖的每个阶段使用照片记录进行渐进式解剖。
   2. 为了保持临床相关性，请特别注意避免扭曲/变形任何结构，以维持心脏的生理形态。
   3. 使用临床相关方向（例如右前斜方向）对目标结构进行成像。
3. 摄影
   1. 将压力灌注和固定的心脏放在三脚架上，该平台安装有多个叉子，并能够 360^度旋转。
   2. 使用数码单镜头反光相机（图 5）²⁴ 拍摄心脏，同时使用 C 型支架上的多个发光二极管灯板和宽大的黑色羽绒被背景布。
   3. 使用长焦距 （200 mm） 镜头拍摄 4-6 英尺的工作距离，以最大限度地减少拍摄对象的失真¹⁴.
4. 浮雕
   1. 要显示立体图像，请从 CT 数据集重建一对照片或体积渲染图像，在水平面上的旋转角度相差 10°。
   2. 使用免费软件¹⁶ 将这些二维 （2D） 图像（称为立体图）转换为立体图。
   3. 要查看立体图，请使用红色/青色眼镜。
5. 摄影 测量
   注:摄影测量是从以不同角度拍摄的多张二维照片中生成三维表面渲染重建的应用科学¹⁷。
   1. 将样品悬挂在 C 型支架上或将其放在旋转台上，以使用智能手机获得数百张多向照片。
   2. 使用市售软件以 FBX 格式生成 3D 模型。
6. CT 扫描
   注意:CT 扫描可以在压力灌注和固定后以及解剖的任何阶段进行。
   1. 将心脏样本悬浮在容器顶部的杆上。为防止心脏在扫描过程中摆动，请用固定在容器底部的塑料尖头支撑心脏底部。因此，空气将起到负对比的作用。
   2. 使用市售的多探测器行 CT 扫描仪进行 CT 扫描，参数如下:管电压为 120 kV，管电流为 800-900 mA，机架旋转为 280 ms。剂量长度产品一般为 500-1200 mGy.cm。
   3. 使用以下参数重建轴向图像数据:截面厚度，0.6 毫米;增量间隔，0.3 毫米;视野，尽可能小（通常为 100-200 毫米）;和一个矩阵，512 × 512。
7. 虚拟解剖
   1. 使用市售软件分析 CT 扫描图像以生成虚拟解剖图像。
      注意:虚拟解剖是体积渲染过程的修改，其中焦点转移到心腔和血管壁¹⁸。在此过程中，手动阈值实际上从原始数据集中删除了增强的腔室。
   2. 通过虚拟解剖可视化非增强的壁、隔膜和瓣膜，以生成类似于大体解剖的图像。与心脏标本的粗略解剖不同，虚拟解剖过程中的切割平面实际上是无限的。几乎任何视图都可以根据需要重新创建以可视化感兴趣的结构。
8. 3D 打印
   1. 在 3D 打印机软件中打开心脏样本的兼容文件。
   2. 在 3D 打印机的打印设置中使用 0.10 mm Fast DETAIL 的配置文件，并将打印速度降低到 20 mm/s。启用 Generate support material（生成支持材料）。
   3. 在 3D 打印机中将 TPU 线材的配置文件 用于"线材设置"。
   4. 将 Original Prusa MK4 Input Shaper 0.4 喷嘴 的配置文件用于打印机中的"打印机设置"。
   5. 切片完成后，将 BGCODE 文件保存在 USB 闪存驱动器中进行 3D 打印。
   6. 使用 1.75 毫米 TPU 细丝进行 3D 打印人体心脏样本。在 3D 打印之前，使用细丝干燥器将 TPU 细丝干燥 6 小时。
   7. 为了减少 3D 打印过程中的线丝张力，请将线轴放在带有内置轴承的线轴支架上，以方便线轴旋转。使用市售的 3D 打印机和纹理粉末涂层钢板进行 3D 打印。
   8. 3D 打印完成后，小心地去除支撑材料。

结果

微量检查
应用组织透明化允许使用共聚焦显微镜对更大体积的组织进行 3D 成像。在心脏中，可以观察到包含心脏神经元的神经节和心肌神经支配的神经模式（图2）。 图 3 显示了神经和平滑肌细胞免疫染色的人左心室心肌的共聚焦图像。观察到血管穿过心肌，并鉴定出许多神经纤维，既与血管相关又独立于血管。

讨论

本研究展示了分析从全人类心脏获得的样本的综合管道。代表性结果显示，对单个心脏进行常规的微观到宏观解剖检查。由于人类心脏样本非常珍贵，因此多尺度方法是理想且有效的，这样就不会通过为各种目的应用多种方案来浪费样本的任何部分，包括科学研究中的发现、临床程序的改进和解剖学教育，同时保持解剖学相关性在整个心脏的背景下。

关于微量检查，免疫染?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P3813
3D Viewer	Microsoft
647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-605-152
647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	713-605-147
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED lens	Nikon
Anti-Actin, α-Smooth Muscle - Cy3 antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Antigen Retrieval Buffer (100x EDTA Buffer, pH 8.0)	Abcam	ab93680
Anti-PGP9.5 (protein gene product 9.5)	Abcam	ab108986
Anti-TH (tyrosine hydrox ylase)	Abcam	ab1542
Anti-VAChT (vesicular acetylcholine transporter)	Synaptic Systems	139 103
Benzyl ether	Sigma-Aldrich	108014
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503-10G
Cheetah 3D printer filament (95A), 1.75 mm	NinjaTek
Coverslip, 22 mm x 30mm, No. 1.5	VWR	48393 151
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-165-152
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997-100ML
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418-500ML
Ethanol, 100%	Decon laboratories	2701
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
GNEXT PET/CT	SOFIE Biosciences
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Histodenz	Sigma-Aldrich	D2158-100G
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Imaging software	Zeiss	ZEN (black edition)
Imaging software	Oxford Instruments	Imaris 10
iSpacer	Sunjin Labs	iSpacer 3mm
KIRI Engine	KIRI Innovation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 880
LEAD-2 - Vertical & Multi-channels Peristaltic Pump	LONGER
Lightview XL	Brightech
Methanol (Certified ACS)	Fischer Scientific	A412-4
Nikon D850	Nikon
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4	NinjaTek
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-121
Original Prusa MK4 3D printer	Prusa Research
PAP pen	Abcam	ab2601
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Polycam	Polycam
Primary antibody
PrusaSlicer 2.7.1	Prusa Research
SARA-Engine	pita4 mobile LLC
Scaniverse	Niantic
Secondary antibody
SlowFade Gold Antiface Mountant	Invitrogen	S36936
Sodium azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical Company	7144.8-32
SOMATOM Definition AS	Siemens Healthcare
Standard Field Surgi-Spec Telescopes,	Designs for Vision
Stereomicroscope System SZ61	OLYMPUS
StereoPhoto Maker	Free ware developed by Masuji Suto
Superfrost Plus Microscope Slides, Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ML
Xylene	Sigma-Aldrich	534056-4L
Ziostation2	Ziosoft, AMIN