高产量和低损伤分离脐带来源的间充质干细胞

摘要

本研究提出了一种独特的钝性解剖程序，以保持沃顿胶 （WJ） 的完整性，从而减少受损的 WJ 并提高收获的间充质干细胞 （MSC） 的数量和活力。与传统的尖锐解剖方法相比，该方法表现出优异的产量和增殖能力。

摘要

间充质干细胞 （MSC） 是一组具有显著再生和免疫调节特性的多能细胞。来自脐带 （UC） 的沃顿胶 （WJ） 作为 MSC 的杰出来源，在生物医学领域引起了越来越多的兴趣。然而，出现了供应有限和现有方法缺乏标准化等挑战。本文提出了一种通过从脐带解剖完整 WJ 来提高 MSC 产量的新方法。该方法采用平割去除上皮层，保持整个 WJ 的完整性，并导致收获的 MSC 的数量和活力增加。与传统的尖锐解剖方法相比，这种方法显着减少了 WJ 废物。为了确保 WJ-MSC 的纯度并最大限度地减少外部细胞影响，在翻转 UC 后利用内部张力剥离内皮。此外，在外植体培养过程中，培养皿短时间倒置，以改善粘附和细胞生长。比较分析证明了所提出的方法的优越性，与传统方法相比，WJ 和 WJ-MSCs 的产量更高，活力更好。两种方法中细胞表面标志物的相似形态和表达模式证实了它们在各种应用中的表征和纯度。该方法为 WJ-MSC 分离提供了一种高产量和高活力的方法，显示出 MSCs 临床应用的巨大潜力。

引言

自 1991 年首次从沃顿商学院果冻 （WJ） 中分离出间充质干细胞 （MSC） 以来，这些多能干细胞因其再生特性和多系分化能力而受到研究人员的极大关注¹。MSC 可以从各种来源分离，包括骨髓、外周血、牙髓、脂肪组织、胎儿（人类流产）和分娩相关组织²。脐带 （UC） 因其非侵入性、丰富的细胞产量和分化能力、高增殖率、分化潜能和免疫调节特性而成为一种很有前途的储存库³。胎儿 MSC 表现出很强的干性和免疫特性，使其成为过去二十年进行的临床试验和基础研究的主要焦点 ^2,4,5。与其他来源的 MSC（如骨髓或脂肪组织）相比，UC 来源的 MSC 具有卓越的治疗潜力 ^6,7。

UC 由羊膜上皮、三根血管（两条动脉和一条静脉）和称为 WJ³ 的凝胶状物质组成。有趣的是，UC 构成了一个简单的脉管系统，仅由内皮和间皮组成，而不包括外膜;WJ 不含淋巴或神经⁸

研究方案

样本来自中国广东省深圳市龙岗区妇幼保健院同意的健康捐献者。北京中医药大学深圳医院伦理委员会 （SZLDH2020LSYM-095） 和深圳市龙岗区妇幼保健院医学伦理委员会 （LGFYYXLLS-2020-005） 批准了人类样本用于研究。所有实验均根据批准的指南进行。材料 表中列出了试剂和所用设备的详细信息。

1. 人体脐带的采集

1. 在无菌条件下从合作医院获取人脐带样本。
   注意：选择 35 岁以下的供体，最好是初产妇，没有肝炎、性传播疾病或遗传疾病病史。乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和巨细胞病毒的入院检查结果需要为阴性。选择剖宫产作为分娩方式。
2. 选择一块长度约为 10-15 厘米的笔直且完整的 UC。
3. 用止血钳闭合两端，并在剖宫产分娩足月新生儿后立即在产钳之间的内端用手术结结扎。（收集的 UC，如图 1 所示，步骤 1）。
   注意：剖宫产手术确保采集物无菌。使用 0 或 2-0 缝合线的手术结以获得更好的抗拉强度。
4. 使用手术剪刀剪断镊子和结之间的绑扎的脐带（图 1，步骤 1）。
5. 用生理盐水冲洗以去除表面的任何污染血凝块，并立即转移到含有 20 mL 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的无菌 ....

讨论

MSC 代表了一个充满活力的研究领域，对再生医学具有深远影响²²。它们的独特特性使它们成为科学探索的焦点，并有可能彻底改变各种疾病和伤害的治疗⁷。WJ-MSC 是 MSC 的一个独特子集，可以从位于血管间上皮和羊膜上皮之间的 UC 内的凝胶状结缔组织获得²³。MSC 的临床应用在于获得足够的细胞数量²⁴。然而，随着传代次数的增.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC anti-human CD44 Antibody	Biolegend	338806
24-well cell culture plates	Thermo Scientific	142475
APC anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	Biolegend	344006
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400122
Autoclave	HIRAYAMA	HVE-50
Automatic Cell Counter	Countstar	FL-CD
BAMBANKER Cryopreservation Solution	Wako	302-14681
Cell Staining Buffer	Biolegend	420201
Centrifugal Machine	Eppendorf	5424R
Clean Bench	Shanghai ZhiCheng	C1112B
CO2 Incubator	Thermo Scientific	HERAcell 150i
D-PBS	Solarbio	D1040
Electro- thermostatic Blast Oven	Shanghai JingHong	DHG-9423A
FITC anti-human CD105 Antibody	Biolegend	323204
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody	Biolegend	328108
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400110
Flow Cytometry	Beckman	CytoFLEX
hemocytometer	Superior Marienfeld	640410
Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10×)	Biolegend	421002
Inverted Biological Microscope	ZEISS	Axio Vert. A1
Liquid Nitrogen Storage Tank	Thermo Scientific	CY50935-70
Normal saline (NS)	Meilunbio	MA0083
PBS	Solarbio	P1032
PE anti-human CD11b Antibody	Biolegend	393112
PE anti-human CD19 Antibody	Biolegend	392506
PE anti-human CD34 Antibody	Biolegend	343606
PE anti-human CD45 Antibody	Biolegend	368510
PE anti-human HLA-DR Antibody	Biolegend	307606
PE Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400114
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	Biolegend	400214
Precision Electronic Balance	Satorius	PRACTUM313-1CN
Snowflake Ice Machine	ZIEGRA	ZBE 30-10
steriled 50 mL plastic tube	Greniner	227270
Thermostatic Water Bath	Shanghai YiHeng	HWS12
Trypsin 1:250	Solarbio	T8150
UltraGRO-Advanced	Helios	HPCFDCGL50
Ultrapure and Pure Water Purification System	Milli-Q	Milli-Q Reference
Xeno-Free Human MSC Culture Medium	FUKOKU	T2011301