医源性损伤概括：电切除技术在大鼠尿道狭窄建模中的应用

摘要

在这项研究中，我们提出了一种通过电切除大鼠尿道而创建的新型、高效且稳定的大鼠尿道狭窄模型，该模型有效地模拟了在临床环境中观察到的医源性损伤。

摘要

尿道狭窄 （US） 是泌尿外科的常见临床疾病，其特征是所有年龄段的患病率和发病率都很高。目前针对 US 的治疗方法，例如尿道扩张和尿道内切开术，未能完全解决该病症，并且与高复发率和并发症相关。

此外，US 的发病机制尚不清楚。为了探索 US 的发病机制并开发新的治疗策略，建立准确反映临床表现的标准化大鼠模型至关重要。本研究概述了一种使用高频电刀在大鼠中诱导 US 的简单且可重复的方法。该方法包括将电刀设置为 4 W 的单极混合切割模式进行纵向切口，这会造成严重的尿道损伤。组织病理学分析显示尿路上皮增厚、炎性浸润和胶原纤维紊乱。该模型通过在大鼠尿道中电切除有效地复制医源性损伤。综上所述，本研究成功建立了一种新的、高效的、稳定的 US 大鼠模型，该模型与临床场景非常相似，为进一步研究 US 的机制和新疗法提供了有价值的工具。

引言

尿道狭窄 （US） 是最古老的泌尿系统疾病之一，并且仍然广泛流行。最近的数据表明，每 100,000 名男性中有 229 至 627 例 US^{病例 1}。患有 US 的人会出现一系列症状，包括下尿路症状²、疼痛³ 和性功能障碍⁴。有几种医学治疗方法可供选择，例如尿道切开术、尿道成形术和扩张术⁵。然而，这些治疗通常因出血、感染和尿失禁等问题而复杂化，从而增加疾病负担并表现出不同的复发率 ^6,7。因此，确定最有效的治疗方法仍然是吸引研究人员和临床医生的关键挑战。

US 通常表现为由尿道粘膜和周围海绵组织纤维化和瘢痕化引起的尿道前部狭窄⁸。尽管 US 很普遍，但人们对 US 的原因和机制知之甚少，并且缺乏合适的动物模型进行深入研究。主要来自经尿道手术的医源性损伤是目前 US 的主要原因，占病例的 41%⁹。因此，美国研究的理想动物模型应该准确复制常见的临床损伤，表现出与人类的基因组和蛋白质组学相似性，并表现出效率和稳定性。这种模型将极大地促进对 US 发病机制的更深入研究和开发更有效的治疗方法。

为了研究常见临床类型的致病过程和机制，已经开发了各种动物模型，使用兔子^10,11、狗¹² 和猪^13,14 等技术，采用电凝、电切除 15 和博来霉素注射¹⁶ 等技术.然而，由于样本量限制和与人类的遗传差异，这些模型经常面临挑战。此外，还必须考虑使用大型动物的成本效益;尽管日常护理费用高昂，但大型动物也存在很大的感染风险，需要广泛的术后护理和相当大的费用。 有据可查的是，啮齿动物在许多器官系统中与人类具有共同的生理和病理特征。最近的一项研究表明，啮齿动物和人类的尿路细胞之间存在同源性¹⁷。此外，大鼠的购买、住房和术后护理成本明显低于大型动物¹⁸。因此，美国的大鼠模型被认为是合适的;然而，这种模型在大鼠中的发展尚未得到充分描述。

先前的研究使用刀片或针头等手术工具在大鼠模型中诱导 US¹⁹。这种方法与损伤尿道周围血管等风险有关，导致大量出血。这些外科手术的主观性质也可能导致机械损伤程度的可变性，缺乏建模的定量标准，这可能会影响后续治疗研究中尿道修复结果的评估。

鉴于这些考虑，显然需要开发一个额外的美国大鼠模型。为了在大鼠中建立高效、经济且稳定的 US 模型，我们在研究中采用了高频电刀机。该模型将有助于在进行临床试验之前进一步研究 US 的机制和评估新的治疗方法。

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研究方案

在这项调查中，使用了 20 只 6 个月大的雄性 Sprague-Dawley 大鼠，每只重 400-500 克。所有动物程序均按照中山大学附属第五医院机构动物护理和使用委员会的指导方针进行（批准号：00349）。这些动物被安置在一个温度和照明条件受控的设施中。尿道狭窄的一个基本特征是在尿道内形成瘢痕形成。根据既定的疤痕形成时间表（通常发生在受伤后 4 周内），我们将术后 4 周标记处尿道中存在可辨别的疤痕组织指定为实验终点。

1. 手术器械的准备

1. 准备以下手术材料：特氟龙涂层导管 （0.6 x 1 mm）、可吸收缝合线 （6-0）、缝合剪刀、组织镊子、持针钳、光滑镊子、高频电外科装置（图 1），包括高频电刀面板、手术电极高频电刀和肛门导电棒（见 材料表）。
2. 用含有 75% 乙醇的酒精湿巾清洁手术区域。
3. 在单极电切割模式下使用高频电刀的准备工作。
   1. 使用电源线将高频电刀连接到接地的 220 V 主电源。
   2. 将消毒的手动刀柄和导电棒插入各自的插座中（图 1C）。
      注意： 确保所有电源线都连接牢固，以维护手术的安全。

2. 动物的准备

1. 将戊巴比妥钠 （60 mg/kg） 吸入注射器中。
2. 用惯用手抓住老鼠的尾巴，用非惯用手抓住老鼠的耳朵和脖子的皮肤，确保老鼠固定牢固。
3. 暴露大鼠的下腹部，并使用浸泡在 75% 乙醇中的棉球对该区域进行消毒。
4. 将注射器针头插入下腹部中线旁约 1-2 毫米处，使其以 45° 角进入腹腔。
   注意：当针头穿透腹膜时，您会感到失去阻力。
5. 轻轻拉回注射器柱塞，确保注射器中没有血液或液体。
6. 慢慢注射戊巴比妥钠。拔出针头，完成注射，然后用浸泡在 75% 乙醇中的棉球再次对该部位进行消毒。
7. 监测老鼠的呼吸节奏并捏住它的后爪以检查反射。
   注意：在进行手术之前，请确认大鼠的呼吸稳定且没有反射。
8. 挤出红霉素软膏，用棉签蘸药膏。用棉签将药膏涂抹在双眼的角膜上，以防止手术过程中角膜干燥。
9. 确认麻醉后，使用电动剃须刀剃除下腹部和会阴。
10. 用蘸有生理盐水的纸巾擦去剃须区域的松散毛发。
11. 用浸泡在碘伏中的纱布海绵擦拭两次对该区域进行消毒，以尽量减少皮肤刺激。
12. 将深度麻醉的大鼠仰卧放在设置为 37°C 的加热垫上。佩戴医用手套，确保手术过程中的无菌状态。

3. 尿道导管插入术和损伤手术

1. 将导电棒插入大鼠的肛门，为高频电刀机建立有效的闭环电路（图 2A）。
2. 对大鼠的尿道进行导管插入，以帮助定位并在手术的后处理步骤中提供支持。
   1. 用石蜡油润滑导尿管。
   2. 通过挤压阴茎周围的皮肤将其从腹部突出来暴露阴茎。
   3. 用浸泡在碘伏中的纱布海绵对大鼠的阴茎进行消毒。
   4. 用光滑的镊子轻轻打开尿道口，然后将润滑的导管插入尿道。
   5. 小心地将涂有特氟龙的导管以尿道收缩的节奏插入尿道;避免任何强行插入（图 2B）。
   6. 如果遇到阻力，轻轻地将阴茎拉向腹侧以调整阴茎的弯曲角度，并继续将导管推进膀胱，直到尿液流出（图 2C）。
   7. 通过确保阴茎与腹部形成大约 45° 的角度来确认导管插入成功（图 2D）。
3. 打开高频电刀机，点击高频刀板的按钮，选择单极混合切割模式，将功率设置为4W，进行下一步逐层电切除阴茎。
4. 将切口与导管对齐。按下电外科刀柄上的黄色按钮，用电刀沿着导管标记线从皮肤到尿道外层切开，直到尿道暴露出来（图 3A、B）。
   注意：确保按下黄色按钮进行电切除，而不是按下蓝色按钮进行电凝。
5. 继续用电刀在尿道上做 0.5 cm 的纵向切口，确保横向直径为 0.1 cm，直到可以看到导管（图 3C）。
6. 使用可吸收缝合线 （6-0） 连续或间断缝合伤口和浅表皮肤（图 3D，E）。
7. 取出尿道导管并重新定位阴茎（图 3F）。
8. 关掉高频电刀，从大鼠肛门中取出导电棒。
9. 用酒精（75% 乙醇）湿巾清洁手术材料。

4. 术后护理

1. 将大鼠放在加热的垫子 （37 °C） 上并密切监测其从麻醉中恢复。仔细注意大鼠的身体状况，包括呼吸节奏、体温和意识水平。
   注意： 在观察到完全恢复之前，不要将大鼠放回笼子中。
2. 将大鼠安置在干净的笼子中，并在水瓶中加入吗啡加标水 （0.4 mg/kg），以便在恢复后进行日常疼痛管理。
3. 给予非甾体抗炎药 （如卡洛芬，0.5 mg/kg，皮下注射） 以使大鼠从术后疼痛中完全恢复。

5. 组织学评估

1. 手术后 4 周，通过抬起大鼠的尾巴来诱导排尿反射。将大鼠放入安乐死箱中，打开 CO₂ 传输管阀，用过量的 CO₂ 对大鼠进行人道安乐死。
2. 确认大鼠一动不动，没有呼吸，并观察瞳孔放大后，关闭阀门。继续观察大鼠的身体状况 2 min，确认安乐死成功。
3. 从安乐死箱中取出老鼠。
4. 用浸泡在 75% 乙醇中的湿巾清洁手术区域和手术材料。
5. 解剖腹部，观察膀胱充盈状态，采集整个尿道。
6. 收获尿道后，将大鼠放入密封袋中，并储存在 4 °C 冰箱中，供实验室技术人员处理。
7. 形态学评估 US 的大体病理学，重点关注组织的颜色和光滑度。
8. 用苏木精和伊红 （H&E） 对尿道组织进行染色，以可视化伤口结构和尿路上皮细胞层。
   1. 将载玻片浸入二甲苯中进行脱蜡（2 x 5 分钟）。
   2. 按顺序在乙醇中再水化载玻片（100% 1 x 3 分钟，95% 1 x 3 分钟，85% 1 x 3 分钟，75% 1 x 3 分钟）。
   3. 用去离子水清洗载玻片（2 分钟）。
   4. 用苏木精对载玻片染色（10 分钟）。
   5. 用去离子水清洗载玻片（5 分钟）。
   6. 用分化溶液（40 s）区分样品。
   7. 用去离子水清洗载玻片（2 x 3 分钟）。
   8. 用伊红对载玻片染色（2 分钟）。
   9. 按顺序在乙醇中再水化载玻片（100% 1 x 3 s、95% 1 x 3 s、85% 1 x 3 s、75% 1 x 3 s）
   10. 将载玻片浸入 100% 乙醇中（1 分钟），并用二甲苯透明载玻片（2 x 1 分钟）。
   11. 加入中性香脂并用盖玻片密封。
9. 将 Masson 的三色染色剂涂抹在尿道组织上，以突出胶原纤维结构。
   1. 将载玻片浸入二甲苯中进行脱蜡（2 x 5 分钟）。
   2. 按顺序在乙醇中再水化载玻片（100% 1 x 3 分钟，95% 1 x 3 分钟，85% 1 x 3 分钟，75% 1 x 3 分钟）。
   3. 用去离子水清洗载玻片（2 分钟）。
   4. 在 Weigert 苏木精铁溶液中对载玻片染色（5 分钟）。
   5. 用去离子水清洗载玻片（5 分钟）。
   6. 用 Biebrich 猩红酸 Fucshin 对载玻片染色（5 分钟）。
   7. 用去离子水清洗载玻片（2 x 3 分钟）。
   8. 用磷酸钼酸溶液对载玻片染色（5 分钟）。
   9. 将玻片置于苯胺蓝溶液中（5 分钟）。丢弃溶液。
   10. 冲洗载玻片，通过酒精脱水，然后用二甲苯清除。
   11. 加入中性香脂并用盖玻片密封。
10. 使用 TGF-β 抗体进行免疫荧光染色，以评估尿路上皮细胞层。
    1. 将适当的抗原修复缓冲液添加到压力锅中。将压力锅放在电炉上，然后将其全功率打开。
    2. 煮沸后，将载玻片从自来水中转移到压力锅中。将冷水倒在炊具上，加热载玻片 10 分钟。
    3. 关闭压力锅并取下载玻片。将载玻片冷却至室温。
    4. 用 PBS 溶液洗涤载玻片。
    5. 用液体阻滞笔标记样品的边缘。
    6. 将载玻片浸入 PBS 加 0.3% Triton X-100 中 30 分钟。
    7. 在 PBS 中轻轻搅拌（2 x 5 分钟）洗涤载玻片。
    8. 在室温下（60 分钟）封闭在 PBS 中的 10% 山羊血清中。
    9. 吸出封闭缓冲液并与一抗在 4 °C 下孵育过夜。
    10. 用 1x PBS 洗涤载玻片（3 x 5 分钟）。
    11. 与在抗体稀释缓冲液中稀释的荧光染料标记的二抗一起孵育。
    12. 用 1x PBS 洗涤载玻片（3 x 3 分钟）。
    13. 安装并密封载玻片。
11. 使用载玻片扫描仪中的 40 倍物镜对染色的载玻片进行数字扫描。
12. 使用参考软件（材料表）分析图像并测量尿路上皮的厚度。
    1. 打开软件。
    2. 单击 Local Computer 以选择染色的载玻片图像。
    3. 单击 Measure Distance （测量距离 ） 以测量尿路上皮的厚度。
    4. 记录尿路上皮厚度的数据。

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结果

本研究中概述的方案成功地在大鼠中建立了稳定的尿道狭窄，并显示出高重现性。手术的平均持续时间为 20 分钟，手术过程中没有出现技术问题。手术后 4 周成功采集尿道标本。

在实验组中，大鼠的膀胱表现出过度膨胀的迹象，而对照组的膀胱是空的（图 4）。这些观察结果表明，在实验建模后，大鼠的排尿功能存在显着损害?...

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讨论

美国造成了沉重的医疗保健负担，对经济产生了重大影响，对身心健康产生不利影响²⁰。仍然需要一种不仅可以完全治愈 US 而且能有效防止其复发的治疗方法。

在这项研究中，我们利用大鼠模型开发了一种简单且可重复的方法来模拟患者的尿道损伤，然后是经尿道手术诱导的尿道损伤。大鼠作为动物模型受到青睐，因为它们具有成?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
absorbable sutures (6-0)	KERONG COMPANY	KR2230814
Animal operating pad	Provided by Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
CaseViewer 2.4	3DHISTECH Ltd.
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
CoraLite488-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Proteintech	SA00013-2
H&E Stain Kit	Abcam	ab150669
high-frequency electrosurgical unit	Beijing Taktvoll Technology Company	ES-100v
Masson staining kit	Merck	HT15
needle-holding pliers	RWD Life Science	S15001-11
Paraffin oil	NA	NA
smooth forceps	RWD Life Science	F13019-12
Sodium pentobarbital	Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
Sprague–Dawley rat	Guangdong Medical Laboratory Animal Center	GDMLAC-035
suture scissors	RWD Life Science	S15001-11
Teflon coated catheter (0.6 mm x 1 mm)	DGZF new materials company	NA
TGF Beta 1 Polyclonal antibody	Proteintech	21898-1-AP
Tissue scissors	RWD Life Science	S13029-14