使用干细胞递送开发脊髓损伤的组合疗法

摘要

在这项研究中，开发并表征了模拟神经的复合水凝胶，可用于研究和利用脂肪来源干细胞的促再生行为进行脊髓损伤修复。

摘要

创伤性脊髓损伤 （SCI） 在损伤部位以下诱导永久性感觉运动缺陷。它影响了美国大约四分之一万人，它代表了一个不可估量的公共卫生问题。已经进行了研究以提供有效的治疗;然而，由于损伤部位的复杂性，SCI 仍然被认为是无法治愈的。研究了多种策略，包括药物递送、细胞移植和可注射生物材料，但仅一种策略限制了它们的再生功效。因此，组合疗法最近引起了人们的关注，可以针对损伤的多方面特征。已经表明，细胞外基质 （ECM） 可能会增加细胞移植对 SCI 的疗效。为此，以不同的比例开发了由脱细胞脊髓 （dSCs） 和坐骨神经 （dSNs） 组成的 3D 水凝胶并进行了表征。dSCs 和 dSNs 的组织学分析证实了细胞和核成分的去除，脱细胞后保留了天然组织结构。之后，以不同的体积比例制备复合水凝胶，并对浊度凝胶动力学、机械性能和嵌入的人脂肪来源干细胞 （hASC） 活力进行分析。在不同比例的水凝胶和脱细胞脊髓基质之间未发现机械性能的显著差异。包埋在凝胶中的人 ASC 在整个 14 天的培养过程中保持活力。本研究提供了一种生成组织工程组合水凝胶的方法，该水凝胶呈递神经特异性 ECM 和促再生间充质干细胞。该平台可以为 SCI 后的神经再生策略提供新的见解，以供未来研究。

引言

大约有 296,000 人患有创伤性 SCI，每年美国约有 18,000 例新的 SCI 病例发生¹。外伤性 SCI 通常由跌倒、枪伤、车祸和体育活动引起，并且通常会导致受伤部位以下的感觉运动功能永久性丧失。SCI 治疗的估计终生费用在每人 1 到 500 万美元之间，预期寿命明显较低¹。然而，SCI 仍然知之甚少，而且在很大程度上无法治愈，主要是由于受伤后复杂的病理生理学后果²。已经研究了各种策略，包括细胞移植和基于生物材料的支架。虽然细胞和生物材料的移植已显示出潜力，但 SCI 的多方面性质表明组合方法可能更有益³。因此，已经研究了许多组合策略，并证明其治疗效果优于单个成分。然而，需要进一步的研究来提供用于递送细胞和药物的新型生物材料³。

制造天然水凝胶的一种有前途的方法是组织脱细胞。脱细胞过程利用离子、非离子、物理和组合方法去除所有或大部分细胞和核酸物质，同时保留 ECM 成分。通过去除所有或大部分细胞成分，ECM 衍生的水凝胶在植入/注射后对宿主的免疫反应较低⁴。为了评估脱细胞组织的质量，需要测量几个参数：细胞/核酸含量的去除、机械性能和 ECM 保存。为避免不良免疫反应，已制定以下标准：1） 每 mg ECM 干重中少于 50 ng 双链 DNA （dsDNA），2） DNA 片段长度小于 200 bp，以及 3） 用 4'6-二脒基-2-苯吲哚 （DAPI） 染色时，几乎没有可见的核材料⁵。机械性能可以通过拉伸、压缩和/或流变测试来量化，并且它们应该与原始组织相似⁶。此外，蛋白质保存可以通过蛋白质组学或定量测定来评估，重点关注脱细胞组织的主要成分，例如脊髓的层粘连蛋白、糖胺聚糖 （GAG） 和硫酸软骨素蛋白多糖 （CSPG） ^7,8。经验证的 ECM 衍生水凝胶可以用不同类型的细胞重新细胞化，以帮助基于细胞的治疗⁹。

已经研究了多种细胞类型，如雪旺细胞、嗅鞘细胞、骨髓来源的间充质干细胞 （MSC） 和神经干细胞/祖细胞，用于 SCI 修复 10,11,12。然而，由于伦理问题、与邻近细胞/组织的稀疏整合、缺乏高产量的组织来源、无法自我更新和/或增殖能力有限，这些细胞的临床使用受到限制 13,14,15。与这些细胞类型不同，人脂肪来源的 MSC （hASC） 是一个有吸引力的候选细胞，因为它们很容易使用脂肪抽吸物以微创方式分离，并且可以获得大量细胞¹⁶。此外，hASC 具有分泌生长因子和细胞因子的能力，这些生长因子和细胞因子具有神经保护、血管生成、伤口愈合、组织再生和免疫抑制的潜力 17,18,19,20,21。

如前所述，已经进行了多项研究 22,23,24，并从中学到了很多东西，但 SCI 的异质性特征限制了它们促进功能恢复的功效。因此，已经提出了组合方法来提高 SCI 的治疗效果。在这项研究中，通过将脱细胞的脊髓和坐骨神经相结合进行三维 （3D） hASC 培养来开发复合水凝胶。通过组织学和 DNA 分析证实成功脱细胞，并通过凝胶动力学和加压试验表征不同比例的神经复合水凝胶。研究了神经复合水凝胶中 hASCs 的活力，以证明这种水凝胶可用作 3D 细胞培养平台。

研究方案

猪组织是商业获得的，因此不需要动物伦理委员会的批准。

1. 猪脊髓脱细胞（预计时间：5 天）

注意：使用先前建立的方案进行脱细胞化，并修改 ^25,26。除非另有说明，否则所有程序均应在室温下的无菌生物安全柜中进行。所有溶液都应使用瓶顶过滤器（0.2 μm 孔径）无菌过滤到高压灭菌的瓶子中。在 37 °C 下进行的程序可以在培养箱或设置为 37 °C 的干净烘箱内进行。

1. 脱细胞溶液的制备
   注：所有溶液均以 1 L 计算。用户可能需要根据其实验需要调整最终所需的体积。
   1. 用 500 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 稀释 500 mL 0.05% 胰蛋白酶/乙二胺四乙酸 （EDTA），制成 0.025% 胰蛋白酶/EDTA。
   2. 用 700 mL PBS 稀释 300 mL 的 10% Triton X-100，制成 3% Triton X-100。将 0.56 g NaCl、1.31 g NaH₂PO₄H₂O 和 10.85 g HNa₂O₄P·7H₂O 在 1 L 去离子水中混合，制成 100 mM Na/50 mM 磷酸盐缓冲液。
   3. 将 32.4 g 蔗糖与 1 L 去离子水混合，制成 1 M 蔗糖。将 40 g 脱氧胆酸钠 （SD） 与 1 L 去离子水混合，制成 4% SD 溶液。用 993.3 mL 4% 乙醇稀释 6.7 mL 15% 过氧乙酸。
2. 猪脊髓的制备
   注：脊髓冷冻运输时不含任何溶液，并保持在 -80 °C 直至使用。
   1. 在脱细胞前，将脊髓在冰箱中于4°C解冻18-24小时。使用无菌剪刀小心去除硬脑膜。
   2. 将脊髓切成小块（约 1 厘米长）。将 1 块放入 15 mL 试管中，或将最多 3 块放入 50 mL 试管中。
3. 脊髓脱细胞
   注意：在每个步骤之后，将脱细胞溶液手动倒入一个大烧杯中以丢弃。小型可高压灭菌的不锈钢过滤器可用于帮助丢弃脱细胞溶液，而不会损失每个步骤所需的组织。除非另有说明，否则脊髓以 83 rpm 的速度搅动。
   1. 用去离子水在 4 °C 和 60 rpm 下冲洗脊髓 18-24 小时。
   2. 用 0.025% 胰蛋白酶/EDTA 在 37 °C 和 40 rpm 下冲洗脊髓 1 小时。然后，用 PBS 冲洗脊髓 15 分钟，2 次。
   3. 用 3% Triton X-100 冲洗脊髓 2 小时。用 100 mM Na/50 mM phos 缓冲液冲洗脊髓 15 分钟，2 次。
   4. 用 1 M 蔗糖冲洗脊髓 1 小时。然后，用去离子水冲洗脊髓 1 小时。
   5. 用 4% SD 冲洗脊髓 2 小时。然后，用 100 mM Na/50 mM phos 缓冲液冲洗脊髓 15 分钟，2 次。
   6. 用 0.1% 过氧乙酸和 4% 乙醇冲洗脊髓 4 小时。然后，用 PBS 冲洗脊髓 1 小时。
   7. 用去离子水冲洗脊髓 1 小时，2 次。然后，用 PBS 冲洗脊髓 1 小时。
   8. 将脊髓在 0.01 mbar 和 -56 °C 下冻干 3 天，然后干燥储存直至使用。

2. 猪坐骨神经脱细胞（预计时间：5 天）

注意：使用先前建立的方案²⁷ 执行脱细胞。除非另有说明，否则所有程序均应在室温下的无菌生物安全柜中进行。所有溶液都应使用瓶顶过滤器（0.2 μm 孔径）无菌过滤到高压灭菌的瓶子中。在 37 °C 下进行的程序可以在培养箱或设置为 37°C 的干净烘箱内进行。

1. 脱细胞溶液的制备
   注：所有溶液均以 1 L 计算。用户可能需要根据其实验需要调整最终所需的体积。
   1. 通过在 1 L 去离子水中混合 1.86 g NaCl、0.262 g d NaH₂PO₄H₂O 和 2.17 g HNa₂O₄P·7H₂O 来制备 50 mM Na/10 mM 磷缓冲液。
   2. 通过将 38.4 g SB-10 与 1 L 50 mM Na/10 mM phos 缓冲液混合，制备 125 mM 磺基甜菜碱-10 （SB-10） 溶液。
   3. 通过在 1 L 50 mM Na/10 mM 磷缓冲液中混合 30 g SD 和 0.24 g SB-16 来制备 3 % SD/0.6 mM 磺基甜菜碱-16 （SB-16） 溶液。
2. 猪坐骨神经的制备
   注意：坐骨神经与 PBS 一起冷冻运输，并保持在 -80 °C 直至使用。
   1. 在脱细胞前18-24小时，在冰箱中于4°C解冻坐骨神经。
   2. 将坐骨神经切成小块（约 1 厘米长）。将 1 块放入 15 mL 试管中，或将最多 3 块放入 50 mL 试管中。
3. 坐骨神经的脱细胞
   注：在每个步骤之后，将脱细胞溶液手动倒入一个大烧杯中进行丢弃，并且可以使用一个小型可高压灭菌的不锈钢过滤器来帮助丢弃脱细胞溶液，而不会损失每个步骤所需的组织。除非另有说明，否则坐骨神经以 15 rpm 的速度搅动。
   1. 用去离子水冲洗坐骨神经 7 小时。然后，在 50 mM Na/10 mM phos 缓冲液中用 125 mM 磺基甜菜碱-10 （SB-10） 冲洗坐骨神经 18 小时。
   2. 用 100 mM Na/50 mM phos 缓冲液冲洗坐骨神经 15 分钟。然后，在 50 mM Na/10 mM phos 缓冲液中用 3% SD/0.6 mM 磺基甜菜碱-16 （SB-16） 冲洗坐骨神经 2 小时。
   3. 用 100 mM Na/50 mM phos 缓冲液冲洗坐骨神经 15 分钟，3 次。然后，在 50 mM Na/10 mM phos 缓冲液中用 125 mM SB-10 冲洗坐骨神经 7 小时。
   4. 用 100 mM Na/50 mM phos 缓冲液冲洗坐骨神经 15 分钟。然后，在 50 mM Na/10 mM phos 缓冲液中用 3% SD/0.6 mM SB-16 冲洗坐骨神经 1.5 小时。
   5. 用 50 mM Na/10 mM phos 缓冲液冲洗坐骨神经 15 分钟，3 次。然后，用 75 U/mL 脱氧核糖核酸酶 （DNase） 冲洗坐骨神经 3 小时，不要搅动。
   6. 用 50 mM Na/10 mM phos 缓冲液冲洗坐骨神经 1 小时，3 次。然后，在 37 °C 下用 0.2 U/mL 软骨素酶 ABC 冲洗坐骨神经 16 小时，不要搅动。
   7. 用 PBS 冲洗坐骨神经 3 小时，3 次。在 0.01 mbar 和 -56 °C 下冻干坐骨神经 3 天，然后干燥储存直至使用。

3. 脱细胞组织的消化和复合水凝胶的制备（预计时间：4 天）

1. 使用剪刀或均质器将脱细胞的组织切碎或研磨成粉末。使用高压灭菌器在 121 °C 下对工具进行消毒，以切碎或研磨组织 45 分钟。环氧乙烷法也适用。
2. 在含有 1 mg/mL、浓度为 15 mg/mL 胃蛋白酶的 0.01 N 盐酸 （HCl） 溶液中分别消化组织。脱细胞脊髓和坐骨神经的估计重量分别为每块 50-100 毫克和 100-150 毫克。
3. 放置磁棒并在 500 rpm 和 4 °C 下搅拌至少 4 天以生成预凝胶溶液。
4. 以以下体积比例混合坐骨神经和脊髓预凝胶：2：1、1：1 和 1：2。使用 1 N 氢氧化钠 （NaOH） 和 HCl 调节 pH 7.4，并使用 M199 培养基和 1x PBS 稀释至所需浓度。在 37 °C 下孵育 30 分钟。
   注：一次添加 1 μL NaOH。M199 培养基可用作 pH 指示剂，因为当 pH 值为 7.4 时它会变成浅粉红色，但应使用 pH 试纸来确认 pH 值。

4. 脱细胞验证

1. 苏木精和伊红染色 （H&E;预计时间：8 天）
   注意：在每个漂洗步骤之后，将溶液手动倒入一个大烧杯中丢弃。
   1. 在 4 °C 下将新鲜和脱细胞的脊髓和坐骨神经在 3.7% 甲醛中固定 18 小时。将一块放入 15 mL 试管中。
   2. 去除甲醛，将组织置于 10% 蔗糖中 1 天。去除 10% 蔗糖，将组织置于 30% 蔗糖中 6 天。
   3. 将适当大小的低温模具填充到最佳切割温度 （OCT） 的一半。放置脱细胞的组织，用 OCT 覆盖它们，并让它们吸收 OCT 1 天。
   4. 1 天后，将组织在 -80 °C 下冷冻过夜。 使用低温恒温器以 10 μm 的厚度对组织进行冷冻切片。
   5. 用 1x PBS 冲洗 5 分钟，2 次。然后，用自来水冲洗 5 分钟。
   6. 用苏木精溶液染色 1 分钟。用自来水冲洗 1 分钟，3 次。
   7. 用伊红溶液染色 1 分钟。用 95 % 乙醇冲洗 1 分钟，2 次，然后用 100% 乙醇冲洗 1 分钟，3 次。
   8. 用二甲苯冲洗 1 分钟、2 分钟，然后 1 分钟。让载玻片干燥 5 分钟。
   9. 使用棉签将 3 - 4 滴邻苯二甲酸二丁酯聚苯乙烯 （DPX） 封片剂溶液滴到载玻片上。将盖玻片放在 DPX 覆盖的载玻片顶部。让载玻片干燥过夜。
2. DNA 分析（预计时间：1 小时）
   1. 称量脱细胞和冻干组织。根据制造商的说明，使用市售试剂盒分离和定量 DNA。

5. 复合水凝胶的表征

1. 凝胶浊度试验（预计时间：1 小时）
   1. 将 100 μL 预凝胶溶液放入冰上 96 孔板的每个孔中。使用读板器每 2 分钟读取 405 nm 处的吸光度，持续 45 分钟。
   2. 使用以下公式计算归一化吸光度：
      （吸光度 -_初始吸光度）/（_最大吸光度 -_初始吸光度）
   3. 计算曲线的斜率和达到 50% 和 95% 凝胶化的时间，分别为 t_1/2 和 t₉₅。
2. 压缩试验（估计时间：每个水凝胶 1 分钟）
   1. 制备浓度为 12 mg/mL、直径为 8 mm、高度为 2 mm 的复合水凝胶。
   2. 使用流变仪以 250 N 的载荷在不锈钢平行板之间以 10% /min 的应变率压缩样品。提供流变仪读数的软件将通过施加力并测量应变直到水凝胶断裂来提供应力-应变曲线。
   3. 根据应力-应变曲线的线性区域的斜率计算杨氏模量。

6. 神经复合水凝胶中人 ASCs 的三维培养

1. 三维 （3D） 平台的准备（预计时间：3 小时）
   1. 用 SU-8 光刻胶蚀刻硅片，以产生深度为 200 μm、直径为 4 mm 的圆形图案。
   2. 以 10：1 的比例混合聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 碱和固化剂。将混合物倒在硅片上，静置 20 分钟，以去除 PDMS 基料和固化剂混合时产生的所有气泡。
   3. 将其放入烤箱中，在 70 °C 下固化 2 小时。 将固化的 PDMS 片材脱模，并使用直径为 8 mm 的活检打孔器打孔，制成 PDMS 微孔。
   4. 将微孔放入 96 孔板中，并将孔板放入空气等离子清洁器中，对 PDMS 微孔进行消毒。
   5. 分别用 1% 聚乙烯亚胺 （PEI） 和 0.1% 戊二醛 （GA） 功能化 PDMS 微孔 10 分钟和 20 分钟。用蒸馏水洗涤微孔 2 次。
2. hASCs 的制备（预计时间：7 天）
   1. 在 hASCs 生长培养基（补充有胎牛血清 （FBS） 和青霉素/链霉素 （Pen-strep）） 的 hASCs 基础培养基）中培养传代细胞 2-5 代，直至汇合。使用血细胞计数器或细胞计数仪传代并计算细胞数。
3. 载有 ASC 的神经复合水凝胶（预计时间：2 小时）
   1. 以 2：1、1：1、1：2 的体积比例混合坐骨神经和脊髓预凝胶，并制备仅脊髓水凝胶，而不混合任何坐骨神经预凝胶。
   2. 添加 M199 培养基并使用 1 N NaOH 和 HCl 调节 pH 7.4。在预凝胶中用生长培养基以 1 x 10⁶ 个细胞/mL 的密度重悬 hASC。
      注：M199 和细胞悬液的量应为预凝胶的 10%。
   3. 使用 1x PBS 将预凝胶稀释至 12 mg/mL。将预凝胶放在微孔上并孵育 30 分钟。在 hASCs 生长培养基中培养载有 ASC 的水凝胶。
4. 细胞活力测试（预计时间：每天 4 小时）
   1. 根据制造商的说明，使用市售试剂制备活力检测溶液。
   2. 在第 1 、 4 、 7 和 14 天吸出培养基。向孔中加入试剂，并按照制造商的说明在 37 °C 下孵育 3 小时。
   3. 使用读板器读取 560/590 nm 激发/发射时的荧光。使用以下公式计算百分比差异：
      [（荧光_样品-荧光_空白）/荧光_空白] x 100

结果

使用先前建立的方案制备脱细胞组织，并稍作修改^26,27。脱细胞、冻干和消化后，制造了 SN：SC = 2：1、1：1、1：2 比例的神经复合水凝胶和仅脊髓水凝胶（图 1）。通过 H&E 染色证实了核成分的去除（图 2A）。为了定量评估脱细胞，在 ECM 内测量残留 DNA。新鲜硬脑膜中的 dsDNA 含量为 13...

讨论

人们普遍认为，SCI 的病理生理学是复杂和多方面的。尽管细胞移植、药物递送和生物材料等单一疗法都为 SCI 提供了有价值的见解，但 SCI 的复杂性可能会限制它们的个体疗效 28,29,30,31。因此，开发有效的组合疗法的努力有所增加。本研究中描述的神经复合水凝胶可作为细胞?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-(Decyldimethylammonio)propane sulfonate inner salt	Sigma-Aldrich	D4266	Used during sciatic nerve decellularization, SB-10
3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propane sulfonate	Sigma-Aldrich	H6883	Used during sciatic nerve decellularization, SB-16
AlamarBlue reagent	Fisher Scientific	DAL1100	Used during AlamaBlue cell viabiiltiy test
Chondroitinase ABC	Sigma-Aldrich	C3667	Used during sciatic nerve decellularization
Cryostat	Leica	CM1860
Deoxyribonuclase	Sigma-Aldrich	D4263	Used during sciatic nerve decellularization
Disodium hydrogen phosphate heptahydrate	VWR	BDH9296	Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
DNeasy Blood & Tissue kit	Qiagen	69506	Used during DNA analysis
Dpx Mountant for histology,slide mounting medium	Sigma-Aldrich	6522	Used during H&E staining
Eosin	Sigma-Aldrich	HT110216	Used during H&E staining
Ethanol	VWR	89125-172
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Used during H&E staining
Glutaraldehyde (GA)	Sigma-Aldrich	G6257	Used during PDMS surface functionalization
hASC growth media	Lonza	PT-4505	Used to culture hASCs, containing of fetal bovine serum and penicilin/streptomycin
Hematoxylin	VWR	26041-06	Used during H&E staining
human adipose-derived stem cell	Lonza	PT-5006
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Used to digest decellularizied tissues and adjust pregels solutions
M199 media	Sigma-Aldrich	M0650	Used to dilute pregels to desired concentration
Optimal cutting temperatue compound	Tissue-Tek	4583
Pepsin	Sigma-Aldrich	P7000	Used to digest decellularized tissues
Peracetic acid	Lab Alley	PAA1001	Used during spinal cord decellularization
Phosphate buffered saline (PBS)	VWR	97062-948
Plate reader	BioTek Instruments	Synergy Mx
Polyethyleneimine (PEI)	Sigma-Aldrich	181978	Used during PDMS surface functionalization
Porcine sciatic nerve	Tissue Source LLC		Live pigs, with no identifiable information and no traceability details
Porcine spinal cord	Tissue Source LLC		Live pigs, with no identifiable information and no traceability details
QuantiFluor dsDNA system	Promega	E2670	Used to analyze DNA contents
Rheometer	TA Instruments	DHR 2
Rugged rotator	Glas-co	099A RD4512	Used during spinal cord decellularization
Sodium chloride (NaCl)	VWR	BDH9286	Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	VWR	BDH9298	Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
Sodium hydroxide solution (NaOH)	Sigma-Aldrich	415443	Used to adjust pregels solutions
SU-8	Kayaku advnaced materials	SU8-100	Used to coat silicon wafer
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501	Used during spinal cord decellularization
Sylgard 184 silicone elastomer kit	DOW	1317318	Polydimethylxiloxane (PDMS) base and curing agent
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Used during spinal cord decellularization
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher	25300062	Used during hASC work and during spinal cord decellularization
Tube revolver rotator	Thermo Fisher	88881001	Used during sciatic nerve decellularization
Xylene	VWR	MK866816	Used during H&E staining