使用山羊肠倒囊演示组氨酸的膜转运:本科生的体验式教学工具

Summary

在这里，我们报道了一种廉价且可重复的方法，证明了组氨酸在山羊肠道中的膜转运。这个过程是通过钠梯度穿过肠上皮细胞膜实现的组氨酸和钠离子的共同转运而发生的。该方法利用体验式学习教学法来更好地了解溶质在生物膜上的运动。

Abstract

组氨酸是一种必需氨基酸，也是与免疫系统、肺通气和血管循环有关的代谢物的前体。膳食组氨酸的吸收在很大程度上依赖于存在于肠上皮细胞顶膜上的 Broad 中性氨基酸转运蛋白 （B⁰AT） 的钠偶联中性氨基酸转运。在这里，我们使用山羊空肠倒囊展示了肠绒毛肠肠上皮细胞从管腔吸收组氨酸。对暴露于不同浓度钠和组氨酸的空肠囊进行测定，以确定囊内组氨酸的浓度随时间的变化。结果显示组氨酸吸收活跃。增加盐浓度导致组氨酸的吸收增加，表明钠和组氨酸在山羊肠道倒囊中的吸收是对称的。该方案可用于可视化氨基酸或其他代谢物的肠道移动性，并进行适当的修饰。我们建议将这个实验作为一种体验式教学工具，可以帮助本科生理解膜运输的概念。

Introduction

生物细胞被膜脂质双层包围，该双层将细胞内胞质溶胶与细胞外内容物分开。该膜充当调节溶质运动的半透性屏障¹。跨生物膜的传输受溶质渗透系数的影响，该系数取决于几个因素，包括溶质的浓度和电荷。一般来说，溶质使用三种机制穿过膜（图 1）:被动扩散、促进扩散和主动运输²。简单扩散是可溶性、不带电荷和非极性溶质通过其浓度梯度通过半透膜的过程（图 1A）。膜蛋白对此过程没有帮助，因为它涉及溶质从较高浓度区域移动到较低浓度区域。扩散速率基于菲克定律³。另一方面，促进扩散是一种蛋白质依赖性运输，其中膜只允许选择性溶质沿浓度梯度通过，而无需消耗能量（图 1B）。这种传递是特异性的，与简单扩散的不同之处在于表现出饱和动力学。

主动运输是分子相对于其浓度梯度的蛋白质依赖性运输，即使用 ATP 或离子梯度从低浓度区域到较高浓度区域（图 1C）。当转运蛋白水解 ATP 时，这种运输称为初级主动运输（图 1C;左面板）。另一种形式的主动运输是二次主动运输（图 1C;右图）。在二次主动传输中，溶质根据电化学梯度移动。当转运蛋白将离子（通常为 Na⁺）沿其浓度梯度的运动与另一个分子或离子与其浓度梯度的运动耦合时，就会发生这种情况。这种溶质运动可以是共传输 （Symport），其中溶质和离子沿同一方向移动，也可以是交换 （Antiport），在这种情况下，溶质和离子沿相反方向移动。

来自食物来源的膳食氨基酸和单糖在小肠中被吸收。小肠在功能上可分为三个部分:十二指肠、空肠和回肠（图 2）。溶质的吸收发生在整个小肠中，最大吸收发生在空肠和回肠的近端。肠肠上皮细胞是极化细胞，连接两个相邻细胞的紧密连接形成两个不同的膜部位——基底外侧和顶膜部位（图 2）。消化产生的管腔溶质的吸收发生在顶膜部位⁴。

组氨酸在顶端膜肠上皮细胞中的转运是钠依赖性的次级活性 symport 的一个例子。在基底外侧端，进入肠上皮细胞的组氨酸沿浓度梯度向下移动到肝门静脉循环中。肠上皮细胞内钠的细胞内浓度维持在 12 mmoles/L¹，低于细胞外/腔浓度，这是由于位于基底外侧膜上的 Na ⁺ K⁺ATP 酶主动将钠泵出细胞（图 3）。在肠上皮细胞的顶膜上，B⁰AT 和钠中性氨基酸转运蛋白 （SNAT） 5 是主要转运蛋白，它们不仅以钠依赖性共转运方式转运组氨酸，还转运天冬酰胺和谷氨酰胺等氨基酸 ^5,6。存在于肠上皮细胞基底外侧膜的另一种称为大氨基酸转运蛋白 （LAT）1 的转运蛋白可跨膜转运亮氨酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等大中性氨基酸⁷。

为了通过体验式学习教学法教授膜运输概念与分光光度法和常规生化分析等技术相结合，必须开发方法，这些方法不仅可以以易于理解的方式展示概念，而且能够为本科生提供参与式学习。目前，可供学生动手学习生物化学概念的资源有限。在这里，我们报告了一种简单的方案，用于证明组氨酸跨山羊肠膜的转运，该方案易于在本科实验室中复制，并且也可用于评估其他代谢物的转运。更重要的是，该方法在本科实验室中使用廉价的材料，从而即使在最简单的实验室环境中也能实现体验式学习。

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Protocol

整个协议及其所有步骤如图 4 中的示意图所示。该方法改编自之前使用大鼠肠道的研究⁸。该实验是按照机构指南进行的。本研究中使用的样品是从商业供应商处采购的。

注意:在本实验期间戴手套。

1. 倒空肠囊的制备

1. 预处理和清洁山羊空肠。
   1. 从有执照的供应商处购买新鲜宰杀的健康山羊的内脏。
   2. 将内脏放入足够的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，使其完全浸入水中进行清洁。
   3. 将小肠与大肠分开，并确保用剪刀去除外部结缔组织。
   4. 使用 10 mL 注射器用 1x PBS 轻轻冲洗小肠，确保去除未消化的食物材料以获得空心的小肠袋。重复此过程至少三次以有效清洁。
      注意: 冲洗时避免用力过大或用针。使用武力会导致肠壁刺穿，从而损害肠上皮细胞。
   5. 用尺子测量小肠的完整长度，得到三个部分:十二指肠（小^{肠的 1} /4）和其余部分均匀分成空肠和回肠。
   6. 使用空肠部分继续进行实验。
2. 准备倒空肠。
   1. 通过使用刀片去除所有结缔组织来清洁空肠部分。
   2. 将空肠切成 12-15 厘米长的部分，用 1x PBS 洗涤，然后放入含有 PBS 的培养皿中。
   3. 使用玻璃棒倒置空肠部分，让绒毛部分暴露在外面。
      注意: 避免使用边缘锋利的玻璃棒。此外，玻璃棒的直径不应大于囊的直径。
      注意:此时，可以在光学显微镜下观察绒毛（图 4）。
   4. 用 1x PBS 轻轻冲洗倒置的空肠部分。
   5. 检查内陷空肠两侧是否有渗漏。
   6. 将倒置的空肠部分切成 5 厘米长的囊。
   7. 用麻绳系住一端，然后用 PBS 填充囊，重新检查被绑带端是否有视觉泄漏。
   8. 系好另一端，在外表面形成一个空的倒置囊，绒毛有绒毛。
   9. 轻拍滤纸上的倒置囊，重新检查是否有外部渗漏。
3. 在 1x PBS 中平衡倒置的囊。
   1. 在同一天进行实验或将囊在 4 °C 的 1x PBS 中储存过夜。

2. 组氨酸转运的实验装置

1. 根据 表 1 中给出的不同氯化钠浓度，组装两组三支 50 mL 试管。
2. 将准备好的肠囊浸入指定的试管中 30 分钟和 60 分钟。
3. 指定时间后，将囊内的溶液倒入单独的 1.5 mL 微量离心管中，并确定体积。
4. 使用 2 mL 注射器吸出囊内的液体。或者，解开囊的一端，将内容物收集在新的 1.5 mL 试管中。
5. 测定 0.1 mL 收集的样品用于组氨酸估计，并使用标准图计算浓度。

3. 使用 Pauly 反应估计组氨酸

1. 准备组氨酸的标准曲线。
   1. 如 表 2 所示，使用组氨酸 （5 mM） 和水的储备溶液制备具有不同浓度组氨酸的溶液。
   2. 向每个试管中加入硫酸 （0.5 mL） 和硝酸钠 （0.5 mL）。
   3. 在室温下孵育试管 5 分钟，然后向每个试管中加入 1 mL 碳酸钠和乙醇。
   4. 在室温 （~20 °C） 下孵育试管 20 分钟，并注意波长 490 nm 处的吸光度。
   5. 绘制吸光度与组氨酸浓度的标准曲线。
      注:组氨酸的该测试基于组氨酸形成重氮化合物的特性（图 5）。

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Results

图 4、表 1 和表 2 说明了通过肠绒毛将组氨酸吸收到倒囊腔中来证明组氨酸肠道移动性的实验工作流程。进行了三个独立的实验设置，代表性数据如图 6 所示。

在给定的实验条件下，使用 Pauly 反应的组氨酸估计遵循 Lambert Beer 定律直至 300 μM（图 6A）。组氨?...

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Discussion

膜转运是教授所有主要生物科学学科（基础或应用）本科生的最基本概念之一。传统上，跨膜运动是使用放射性同位素标记的代谢物进行可视化的。然而，这些方法极其危险，不适用于教学或学习。虽然体验式学习是理解这些复杂概念的最佳教学技术，但缺乏基础设施、昂贵的基于荧光的染料/代谢物以及最重要的是，禁止动物解剖实验，进一步加剧了这一挑战。因此，?...

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	TARSONS	500020
10 mL Test Tubes	BOROSIL	9800U04
50 mL Sterile Falcon Tubes	TARSONS	546041
500 mL Beaker	BOROSIL	10044977
500 mL Conical Flask	BOROSIL	691467
D-Glucose	SRL	42738
Digital Spectrophotometer	SYSTRONICS	2710
Ethanol	EMSURE	1009831000
Finpipettes	THERMOFISHER	4642090
Glass Stirrer Rod	BOROSIL	9850107
L-Histidine	SRL	17849
NaCl	SRL	41721
Nitrile Gloves	KIMTECH	112-4847
Petri Dish	TARSONS	460090
Phosphate Buffered Saline (ph 7.4)	SRL	95131
Pipette Tips	ABDOS	P10102
Sodium Carbonate	SRL	89382
Sodium Nitrate	SRL	44618
Sodium Phosphate Dibasic (anhydrous)	SRL	53046
Sodium Phosphate Monobasic (anhydrous)	SRL	22249
Sulphanilic Acid	SRL	15354