使用 ELISA 测定定量 8-oxo-dG 水平以评估 MCF-7 细胞中的氧化 DNA 损伤

摘要

该方案描述了一种通过 ELISA 技术定量检测 MCF-7 细胞中 DNA 氧化损伤的有效方法。

摘要

8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷 （8-oxo-dG） 碱基是常见的 DNA 氧化损伤的主要形式。DNA 损伤对基因表达产生深远影响，是刺激神经退行性疾病、癌症和衰老的关键因素。因此，8-oxoG 的精确定量在 DNA 损伤检测方法的研究中具有临床意义。然而，目前，现有的 8-oxoG 检测方法在便利性、便利性、可负担性和更高的灵敏度方面提出了挑战。我们采用夹心酶联免疫吸附测定 （ELISA） 技术，一种高效、快速的比色法，检测用不同浓度的过氧化氢 （H₂O₂） 刺激的 MCF-7 细胞样品中 8-oxo-dG 含量的变化。我们通过检测 MCF-7 细胞中诱导 MCF-7 细胞氧化损伤的 H₂O₂ 浓度₅₀ 来确定其浓度。随后，我们用 0、0.25 和 0.75 mM H₂O₂ 处理 MCF-7 细胞 12 小时，并从细胞中提取 8-oxo-dG。最后，对样品进行 ELISA。经过一系列步骤，包括铺板、洗涤、孵育、显色、终止反应和数据收集，我们成功检测到 H₂O₂ 诱导的 MCF-7 细胞中 8-oxo-dG 含量的变化。通过这些努力，我们的目标是建立一种评估细胞样本中 DNA 氧化损伤程度的方法，并在此过程中推动开发更方便、更方便的 DNA 损伤检测方法。这项工作有望为探索 DNA 氧化损伤与各个领域之间的关联分析做出有意义的贡献，包括疾病的临床研究和有毒物质的检测。

引言

DNA 氧化损伤是活性氧 （ROS） 的产生与细胞抗氧化防御系统之间不平衡的结果¹。它主要涉及 DNA 嘌呤和嘧啶碱基的氧化 ^2,3。DNA 碱基的这种氧化修饰不仅损害了基因组的完整性，而且还包含广泛的病理问题，包括癌症、神经退行性疾病和心血管疾病 ^4,5。DNA 中的鸟嘌呤碱基具有最低的还原电位，并且最易氧化⁶。因此，8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷 （8-oxo-dG） 是评估 DNA 氧化损伤程度的主要标志物 ^7,8。8-oxo-dG 的准确定量已成为解决疾病发生、进展和评估多因素氧化负荷的各个方面的关键问题⁹。

检测 8-oxo-dG 的传统方法，如高效液相色谱-电化学检测 （HPLC-ECD）、质谱和相关联用技术，表现出高灵敏度和特异性 10,11,12。然而，这些技术通常具有复杂的操作要求和高成本，这阻碍了它们在高通量样品分析中的广泛适用性和实用性。随着科学技术的不断进步，出现了各种新颖、高效、准确的方法。这些新技术的应用使我们能够更准确地量化 8-oxo-dG 的水平，并为深入研究氧化应激与疾病之间的关联提供更有力的工具。例如，研究人员应用纳米孔技术对 DNA 进行定量检测和测序¹³，使用单击式代码测序策略识别 DNA 损伤类型¹⁴，开发高通量测序方法，并通过将生物素-链霉亲和素与 ELISA 整合来创建基于 8-oxoG 的生物传感器¹⁵。其中，ELISA 在特异性、高通量筛选和成本方面具有公认的优势，是 8-oxo-dG 检测的理想解决方案之一。因此，开发一种高通量、高灵敏度、方便、快速的 8-oxo-dG 检测方法至关重要。

酶联免疫吸附测定 （ELISA） 技术开发于 1971^{年 16} 年，在过去 50 年中迅速发展，现已成为生物学和医学领域最常用的检测方法之一 17,18,19。ELISA 技术具有高灵敏度和特异性，反应时间短，易于使用，是大规模样品检测和高通量分析的广泛认可选择²⁰。因此，ELISA 已广泛用于细胞内化合物、蛋白质、抗体或分子的定量或半定量分析 21,22,23。例如，它已被用于检测与各种疾病、药物残留和生物分子相关的生物标志物²⁴。根据实验设计和原理，ELISA 可分为四种主要类型²⁵。这些方法包括直接 ELISA、间接 ELISA、夹心 ELISA 和竞争性 ELISA^26,27。其中，夹心 ELISA 利用两种特异性抗体，一种用于捕获靶分子，另一种用于检测，被选中用于本文的研究。夹心 ELISA 的实验原理如下:首先，将特异性抗体固定在微孔板的孔中以捕获目标分析物。添加标准品或样品后，目标分析物与固定化抗体结合。随后，加入识别抗原上不同表位的标记抗体，形成夹心结构。去除未结合的抗体后，添加底物。在二抗的催化作用下，发生有色反应，颜色的强度与样品中目标分析物的浓度呈正相关。最后，测量光密度 （OD） 以确定样品的浓度。夹心 ELISA 具有对目标样品的灵敏度和特异性更高等优点，这使其适用于检测低浓度的目标分析物和复杂样品²⁸。此外，获得的结果可以量化以供进一步分析。这些因素使夹心 ELISA 成为科学研究和临床实验室中常用的检测方法²⁹。

本研究旨在定量检测 MCF-7 细胞中的 8-oxo-dG，以确定细胞中 DNA 氧化损伤的程度。本研究包括两个主要部分:构建 MCF-7 细胞 DNA 氧化损伤模型和使用 ELISA 检测 8-oxo-dG。首先，在体外培养 MCF-7 细胞，并用不同浓度的 H₂O₂ 处理不同的持续时间。使用 CCK-8 测定法评估细胞活力，以确定 MCF-7 细胞中 H₂O₂ 的半数最大抑制浓度 （IC₅₀）。根据 IC₅₀ 值，选择合适的 H₂O₂ 处理时间和诱导浓度。为了提取因氧化损伤而受损的 MCF-7 细胞样品，获得细胞样品和上清液，并将其添加到先前涂有 8-oxo-dG 抗体的酶联孔中。样品中存在的 8-oxo-dG 将与与固相载体结合的抗体结合。然后，加入用辣根过氧化物酶标记的 8-oxo-dG 抗体。将反应混合物在恒温下孵育，以确保样品与抗体完全结合。洗涤除去未结合的酶，然后加入比色底物，产生蓝色。在酸的作用下，溶液变黄。最后，在 450 nm 处测量反应孔样品的 OD 值，样品中 8-oxo-dG 的浓度与 OD 值成正比。通过生成标准曲线，可以计算样品中 8-oxo-dG 的浓度。

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研究方案

1. 在MCF-7 细胞中构建 H₂O₂ 诱导的 DNA 氧化损伤模型

1. MCF-7 细胞回收
   1. 将含有 3.5 x 10⁶ 个 MCF-7 细胞并储存在 -80°C 冰箱中的细胞培养低温管快速转移到含有液氮的泡沫盒中。用镊子取出试管，并将其置于 37 °C 恒温水浴中约 1 分钟以解冻保存的细胞。
      注:在水浴中解冻过程中，间歇性摇动细胞，以确保冻存管均匀加热。
   2. 将冷冻管放入离心机中，并在室温下以 150 x g 离心 5 分钟。
   3. 使用移液器从低温储存管中弃去上清液，并加入 1 mL 完全培养基。充分混合并转移至 10 mm 培养皿中，再补充 7 mL 完全培养基。
   4. 以纵横交错的方式摇动培养皿以确保均匀混合，并在 37 °C 和 5% CO₂ 的 CO₂ 培养箱中培养。
      注:完全培养基由补充有 10% 胎牛血清、1% 青霉素和链霉素的 DMEM 培养基组成。
2. 细胞活力评估
   1. 选择对数生长期具有良好细胞状态的 MCF-7 细胞进行实验。在对数生长期，细胞通常表现出较短的分裂周期和较高的细胞分裂频率。
      1. 使用电子显微镜观察 MCF 细胞的形态和生长速率。当细胞呈现均匀而密集的单层形态，并且细胞增殖明显时，可以确定细胞基本上处于对数生长期。
   2. 细胞洗涤:用移液管从培养皿中取出培养基，加入 1 mL PBS 缓冲液洗涤细胞，然后弃去 PBS。
   3. 细胞分离:加入 1 mL 胰蛋白酶洗涤细胞，等待约 1 分钟，让胰蛋白酶将细胞从培养皿中完全分离。轻轻敲击培养皿;观察细胞运动
      in sheets 表示细胞彻底分离。
   4. 终止细胞分离和细胞计数:加入 8 mL 完全培养基以终止分离，轻轻移液细胞，并使用细胞计数仪测定细胞悬液浓度。
      注:在计数前，轻轻上下吹打，确保细胞悬液均匀。
   5. 细胞接种:调整稀释的细胞悬液，使细胞密度达到每 100 μL 5,000 个细胞。使用移液枪将细胞悬液接种到 96 孔板的 21 个孔中，向每个孔中分配 100 μL。将 100 μL PBS 缓冲液添加到接种孔的周围孔中，以防止培养基过度蒸发。
   6. 含 H₂O₂ 的培养基的制备:在 12 孔细胞培养板上选择 9 个孔，并根据 H₂O₂ 浓度的梯度（0、0.25、0.50、0.75、1.0、1.5、2.0 mM）分配标记。向标记为 2.0 mM 和 1.5 mM 的孔中加入 720 μL 完全培养基，并向其余孔中加入 360 μL 完全培养基。
      1. 使用移液管，将 1.63 μL 和 1.22 μL 的 3% H₂O₂ 试剂分别分配到标记为 2.0 mM 和 1.5 mM 的孔中。充分混合溶液。使用移液管将 360 μL 的 2.0 mM H₂O₂ 转移到标记良好的 1.0 mM 中并混合;然后，将 360 μL 的 1.0 mM H₂O₂ 转移到标记良好的 0.5 mM 中并混合;最后将 360 μL 的 0.5 mM H₂O₂ 转移到标记良好的 0.25 mM 中。将 360 μL 的 1.5 mM H₂O₂ 移液到标记良好的 0.75 mM 中以稀释并达到所需的浓度。（图 1）。
         注意:确保移液器中的 H₂O₂ 储备液完全转移到孔中，以避免任何残留溶液。在进行稀释之前，确保溶液充分混合。
   7. 孵育:细胞接种约 24 小时后，一旦细胞粘附到表面，使用移液器从 96 孔板中取出培养基。根据浓度梯度，向每个孔中加入相应的含 H₂O₂ 的培养基。将板放回培养箱中 12 小时。
   8. 添加 CCK-8 试剂:在指定的 12 小时处理期后，使用移液器从 96 孔板中取出培养基，向每个孔中加入 100 μL 完全培养基和 10 μL CCK-8 试剂，并包括三个空白对照孔。将板在 37 °C 下孵育 2 小时。
      注意:在添加样品的过程中，请避免形成气泡，以防止对 OD 值读数产生任何干扰。
   9. 吸光度测量:从培养箱中取出 96 孔板，使用酶标仪测量 450 nm 波长的吸光度，并记录结果。
   10. 根据IC₅₀ 的计算公式，
       抑制率（%）=（药物实验组OD-药物对照孔平均OD）/（细胞对照孔平均OD-药物对照孔平均OD）×100%
       将结果计算为对照培养物中吸光度的百分比。
   11. 将处理后的实验数据导入统计分析软件，选择分析类型 非线性回归，构建四参数 logistic 模型，然后单击 拟合曲线 按钮进行曲线拟合。拟合过程之后，软件将自动计算 IC₅₀ 值。
3. H₂O₂ 诱导的 MCF-7 细胞氧化实验
   1. 检索对数生长期具有良好细胞状态的 MCF-7 细胞以进行实验。
   2. 洗涤，进行细胞分离，终止分离，并对细胞进行计数（有关具体方法，请参阅步骤 1.2）。
   3. 细胞接种:将细胞悬液的密度调整为每培养皿 1 x 10⁶ 个细胞，每 6 cm 直径培养皿 4 mL 悬浮液。
   4. 将两个 5 mL 微量离心管标记为 0.25 mM 和 0.75 mM 3% H₂O₂。向每个试管中加入 4 mL 完全培养基，然后分别加入 1.13 μL 和 3.40 μL 的 3% H₂O₂。轻轻摇动试管以确保充分混合。用含有 0、0.25 和 0.75 mM 的 H₂O₂ 浓度的完全培养基替换三个培养皿中的培养基。
   5. 孵育培养物:将培养皿放回培养箱中 12 小时。

2. 细胞样品的制备和 ELISA 试剂的制备

1. 细胞提取物样品的收集
   1. 样品采集:弃去 MCF-7 细胞培养上清液，冲洗，进行细胞分离，终止分离，并收集细胞。将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中。
   2. 离心:以 800 x g 离心 5 分钟以收集细胞沉淀。添加 200 μL PBS 以重悬每个细胞样品，并通过重复冻融循环破坏细胞。将细胞裂解物以 1,500 x g 离心 10 分钟，并使用移液管收集上清液进行分析。
      注:当细胞量低时，减少用于重悬的 PBS 体积。如果无法立即分析，样品可在 4 °C 下储存长达 1 周。对于长期储存，根据一次性使用量将样品分装并储存在 -80 °C 以避免重复冻融循环。
2. ELISA 试剂的制备
   1. 试剂解冻:让 ELISA 试剂（包括密封膜、预包被板、标准品、样品稀释剂、检测抗体-HRP、显色底物、终止液、浓缩洗涤缓冲液 （20x） 和测试样品达到室温 （18-25 °C） 20 分钟，然后再开始检测。使用前 15 分钟预打开 ELISA 读数仪。
   2. 洗涤缓冲液的制备:计算所需体积的稀释洗涤缓冲液，然后用蒸馏水或去离子水将 20 倍浓缩洗涤缓冲液稀释成 1 倍工作溶液。将任何未使用的浓缩洗涤缓冲液放回 4 °C 冰箱中。
      注意:洗涤缓冲液在使用前应新鲜制备。如果储存在冰箱中的浓缩洗涤缓冲液中存在晶体，请使其达到室温并轻轻摇晃，直到晶体完全溶解后再使用。
   3. 标准品的编制
      1. 制备浓度分别为 1.25、2.5、5、10、20 和 40 ng/mL 的标准样品的工作溶液。为保证实验结果的准确性，使用前应小心地上下混合标准样品，以避免在溶出过程中形成气泡。

3. ELISA 实验

1. 板涂层:提前设计标准品、样品和空白/对照品的孔总数，并取出所需的板条。向反应孔中加入 50 μL 标准工作溶液和不同浓度的检测样品。一式三份执行标准品，避免将任何样品添加到空白/对照孔²⁵ 中。
   注意:ELISA 测定的实验步骤如图 2 所示。如果样品浓度超过检测范围，样品应在取样前用样品稀释剂稀释。添加样品时，将其添加到板底部，避免接触孔壁，轻轻摇晃混合，避免形成气泡。为确保实验的准确性，每次样品添加应在 10 分钟内完成。
2. 孵育:除空白孔外，向每个反应孔中加入 100 μL 辣根过氧化物酶 （HRP） 偶联的检测抗体，用板密封密封孔，并在 37 °C 下在恒温培养箱中孵育 60 分钟。
3. 洗涤:弃去液体，抖掉板孔中的液体，在吸水纸上拍干，向每个反应孔中加入 350 μL 洗涤缓冲液，静置 1-2 分钟，然后丢弃洗涤缓冲液。重复洗涤过程 5 次。
   注意:彻底清洗至关重要，因为它直接影响实验结果的准确性。确保每次洗涤后洗涤缓冲液完全抖落。洗涤后小心擦去板底部的残留物，以免影响吸光度测量。
4. 显色反应:向每个反应孔中加入 50 μL 底物 A 和 50 μL 底物 B，密封板并在 37 °C 下避光孵育 15 分钟。
   注:添加显色剂后，及时观察反应孔中的颜色变化。如果颜色太深，请添加终止液以提前终止反应。
5. 终止反应并测量吸光度:向每个反应孔中加入 50 μL 终止液，并立即用 ELISA 读数仪测量 450 nm 波长处的 OD 值（15 分钟内）。
6. 数据分析:将处理后的实验数据导入统计分析软件中，选择分析类型 Linear Regression。通过将 X 轴上标准品的浓度与 Y 轴上的光密度 （OD） 值作图来构建校准曲线。利用建立的校准曲线来确定样品中存在的 8-oxo-dG 的浓度。构建一个 Logistic 数学模型，然后单击 Fit Curve 按钮进行曲线拟合。在拟合过程之后，软件会自动计算标准曲线和 P 值。
   注意:标准曲线不能重复使用，需要为每个实验重新确定。

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结果

如图 3 所示，X 轴表示应用于 MCF-7 细胞的 H₂O₂ 浓度，而 Y 轴表示细胞活力。用 0.75 mM 处理 12 小时将 MCF-7 细胞的活力降低至 67%。伴随着浓度的增加，MCF-7 细胞的活力显着降低，尤其是在 1.5 mM 的浓度下，活力下降到 3% 以下（表 1）。实验结果表明 MCF-7 细胞的 IC₅₀ 为 0.7655 mM。

在这一系列实验中，我们采用了增强的 ELIS...

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讨论

ELISA 方法的开发对于现有和新的 DNA 损伤检测方法都非常重要。与传统的 HPLC 和质谱技术相比，这种方法不仅用户友好，而且灵敏度高，满足高通量筛选的要求³⁰。这使得在大规模疾病筛查研究中监测 8-oxo-dG，有助于更深入地了解该生物标志物与各种疾病之间的相关性。

在实验过程中，几个关键步骤对于确保结果的可靠性和可重复性至关重要。最初，实验熟?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA(1x)	Gibco	25200-072
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
Cell Counting Plate	QiuJing	XB-K-25
CO2 incubator	Thermo	51032872
DMEM basic(1X)	Gibco	C11995500BT
FBS	PAN	ST30-3302
GraphPad Prism X9	GraphPad Software		statistical analysis software
high-speed centrifuge	Thermo	9AQ2861
Human 8-oxo-dG ELISA Kit	Zcibio	ZC-55410
L-1000XLS+ Pipettes	Rainin	17014382
L-20XLS+ Pipettes	Rainin	17014392
liquid nitrogen tank	Mvecryoge	YDS-175-216
MCF-7 CELL	BNCC	BNCC100137
Multiskan FC microplate photometer	Thermo	1410101
PBS	Solarbio	P1020
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Beyotime	C0222
Trinocular live cell microscope	Motic	1.1001E+12
Ultra-low temperature freezer	Haire	V118574