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本文内容

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摘要

本方案描述了使用微电极在人体组织来源的胃类器官中进行 pH 值测量，用于腔内生理学的时空表征。

摘要

胃肠道类器官模型的优化和详细表征需要先进的方法来分析其管腔环境。本文提出了一种高度可重复的方法，用于通过显微操纵器控制的微电极精确测量 3D 人胃类器官管腔内的 pH 值。pH 微电极是市售的，由直径为 25 μm 的斜面玻璃尖端组成。为了进行测量，将 pH 微电极推进到悬浮在 Matrigel 中的类器官 （>200 μm） 的内腔中，而参比电极则浸没在培养板的周围培养基中。

使用这种微电极来分析来自人胃体的类器官，我们证明每个培养孔内的管腔 pH 值在 ~7.7 ± 0.037 之间相对一致，并且可以获得至少 15 分钟的连续测量。在一些较大的类器官中，测量结果显示上皮表面和管腔之间存在 pH 梯度，这表明类器官中的 pH 值测量可以以高空间分辨率实现。在之前的一项研究中，微电极成功用于测量类器官中的管腔氧浓度，证明了这种方法在类器官分析中的多功能性。总之，该协议描述了 3D 类器官中复杂管腔空间功能表征的重要工具。

引言

类器官（源自干细胞的微型多细胞结构）彻底改变了我们研究人类生理学的能力，并开始取代动物模型，即使在监管环境中也是如此1。自 2009 年 Sato 等人首次描述肠道类器官以来，类器官技术已变得非常流行2。大量研究非常详细地表征了类器官模型的细胞组成和功能 3,4,5,6。然而，这些 3D 多细胞结构的管腔空间在很大程度上仍未定义 7,8。管腔是来源于粘膜组织的类器官的中央腔，被极化上皮细胞的顶端部分包围。由于细胞的分泌和吸收主要发生在顶端上皮表面，因此类器官的管腔微环境受这些重要的生理过程控制。目前使用的类器官模型展示了细胞信号传导模式、整体干性、代谢物浓度梯度和环境条件的变化9。因此，了解类器官管腔生理学对于器官功能和病理学的准确建模是必要的。不幸的是，管腔的相对不可接近性严重阻碍了 3D 类器官10 中管腔生理学的功能分析。

检查 pH 值曲线的能力在胃中尤为重要，胃因具有体内最陡峭的质子梯度而臭名昭著，范围从管腔的大约 1-3 到上皮的接近中性 11,12,13。我们对胃 pH 梯度的微观尺度维持的理解，以及类器官模型在概括胃粘液层的这种动态环境方面的相关性，仍然存在很大差距。类器官 pH 值分析的传统方法涉及使用 pH 敏感染料，这些染料可以是荧光或比色指示剂。McCracken 等人使用将 SNARF-5F-a 比率 pH 指示剂管腔注射到类器官中，以分析管腔 pH 值响应组胺处理的下降。此类染料可以掺入培养基中，从而实现实时、非侵入性的 pH 值监测。不仅对 pH 敏感的染料需要复杂的校准步骤，这会导致测量的可靠性和准确性不佳，而且此类染料也往往在特定的检测范围内工作，可能无法代表目标微环境中的整个 pH 值范围14,15。然而，使用指示剂染料进行验证实验可以被认为是合理的。还开发了使用基于荧光光的 pH 传感方法的光学纳米传感器;然而，这种传感技术需要显微镜成像，并且还容易受到光漂白、光毒性以及成像偏差的影响16,17。此外，Brooks 等人有 3D 打印的多孔板，其中包含微电极，其上可以电镀类器官18。然而，这种方法不允许直接在类器官腔内进行测量。

与其他方法相比，基于电极的 pH 测量可以提高准确性，并提供实时 pH 监测。此外，安装在显微操作器上的 pH 电极可实现卓越的 pH 测量空间分辨率，因为可以精细控制电极尖端的精确位置。这在类器官模型的分析中实现了尽可能高的灵活性和可重复性。这里使用的电极是微型 pH 微电极，其工作原理是质子通过围绕细铂丝的选择性 pH 玻璃的扩散。微电极连接到外部 Ag-AgCl 参比电极，然后连接到高阻抗毫伏表。当浸没在同一溶液中时，两个电极尖端之间的电势将反映溶液的 pH值 19.这种显微分析系统已用于生物膜20,21、浮游藻类 22、人痰液样本 23 甚至间充质干细胞球体24 的代谢分析。我们的实验室和 Murphy 等人以前都使用显微操纵器控制的 O2 微电极来评估类器官管腔中的氧浓度。Murphy 等人将这种方法与数学建模相结合，以揭示其球状体内的氧梯度。与周围的细胞外基质相比，我们小组能够发现组织来源的胃类器官中的管腔氧水平降低25。

在这里，我们提供了一种详细的方法，用于对球形胃肠道类器官中的管腔 pH 值进行手动微电极分析，这将有助于增强对其复杂管腔微环境的生理理解。我们预计这项技术将通过在微观尺度上实时、高分辨率地测量 pH 值，为类器官生理学的探索增加一个新的维度。此外，以下方案可以很容易地适用于各种类型类器官模型中的 O2、N2O、H2、NO、H2S、氧化还原和温度的分析。生理学分析是优化类器官培养条件以更好地模拟 体内 环境的宝贵工具，从而提高类器官模型在生物医学研究中的相关性和实用性。

研究方案

该协议需要直径至少 200 μm 的 3D 类器官，这些类器官具有不同的腔并嵌入人工细胞外基质（ECM，例如 Matrigel）中。用于类器官衍生的人体胃组织是在蒙大拿州立大学机构审查委员会的批准和在 Bozeman Health 接受上消化道内窥镜检查的患者的知情同意下获得的（方案 # 2023-48-FCR，至 D.B.）或作为国家疾病研究交流的豁免全胃或袖状胃切除术标本（方案 #DB062615-EX）。表 1 提供了有关本研究中使用的类器官系和传代号的信息，表 2 列出了培养基组成。请参阅先前发布的胃肠道类器官系生成和维持方案 6,26,27。

1. 制备用于 pH 值的人胃类器官

  1. 使用标准方案启动和维持胃类器官培养。将类器官保存在 24 孔板上，每孔 500 μL 扩增培养基中（表 2）。每 5-7 天传代建立的类器官系，转移到 35 mm 玻璃底培养皿中，为 pH 分析实验做准备。
    注意：我们实验的类器官培养物来源于胃腺制剂，如上所述，这些制剂是从成人组织中获得的。如前所述，我们使用胶原酶组织消化方法在它们悬浮在 ECM 中之前分离这些腺体 25,28,29。
  2. 从第 1-15 代活跃生长的类器官培养物中，选择包含至少 100 个直径在 200 至 700 μm 之间的类器官（约 200 万个细胞）的孔，以便在 3.5 mm 培养皿上进行转移和扩增。
  3. 在准备用于接种的类器官（步骤 1.4-1.8）时，让细胞外基质 （ECM） 等分试样在冰上解冻至少 45 分钟。在整个方案中将 ECM 保持在冰上以防止凝胶化。将细胞培养板置于 37 °C、5% CO2 培养箱中预热细胞培养板。
  4. 从孔中取出培养基，并通过将冰冷的 PBS 移液到每个 ECM 液滴上并用 P1000 移液器的尖端刮擦凝胶来收获胃类器官培养物。将含有类器官的 ECM 片段的 PBS 移液到 15 mL 锥形管中。
  5. 将试管在 4 °C 下以 200 × g 离心 5 分钟。含有类器官的 ECM 片段将在试管底部显示为一层。小心吸出上清液，将 350 μL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 移液到每个试管中，通过上下移液轻轻混合。将试管在 37 °C 水浴中孵育 2-5 分钟。
  6. 与胰蛋白酶-EDTA 孵育后，向每管中加入 600 μL 冰冷的 DMEM 和青霉素/链霉素，并用力上下移液至少 40 次。在 4 °C 下以 200 × g 离心 5 分钟。吸出上清液。为了构建用于 pH 测量的培养物，将细胞沉淀以类器官沉淀与 ECM 的 1：4 v/v 比率重悬于冰冷的液体 ECM 中以进行电镀。
  7. 对于每个样品，沿 35 mm 玻璃底培养皿的直径将 40 μL 含有类器官/类器官片段的液体 ECM 铺在一条细的水平线上。
    注：将凝胶排成一行而不是圆形液滴分配到板上，通过稀释培养物，可以更轻松地接触到单个类器官。
  8. 让凝胶聚合 15-30 分钟;然后，沿着孔边缘移液，小心地将 2 mL 类器官扩增培养基添加到板中，以避免干扰凝胶。
  9. 每隔一天更换一次介质。等待 4-8 天，让至少 10 个类器官生长到最小直径 400 μm。
  10. 要进行 pH 分析实验，请确保每个培养物至少包含 10 个符合以下标准的类器官：直径>200 μm，外观健康（在用明场显微镜观察的类器官中几乎看不到深色物质），并且没有其他类器官过度拥挤。

2. 微电极的开箱和校准

注：为了实现微量测量，除了 pH 传感器微电极外，还使用了单独的参比电极，而不是使用集成（因此更笨重）的设计。pH 微电极和参比电极都必须湿润存放。一次不要暴露在空气中超过 10 分钟。确定适合应用的针尖尺寸。在这里，我们使用了斜面尖端直径为 25 μm 的电位 pH 微电极。

  1. 在微电极仍在其保护管中的情况下，目视检查尖端是否有任何损坏。
  2. 通过连接器将参比电极连接到 pH 电极电缆。然后，通过 USB 电缆将微电极连接到放大器，并将放大器连接到带有软件的接地 PC（图 1A）。
  3. 用 70% 乙醇和去离子 H2O （diH2O） 填充两个 50 mL 锥形管 2/3。将微电极和参比电极放入 diH2O 管中，确保两个尖端都浸没在液体中至少 1 cm。
    注意：高烧杯也可用于此步骤和类似步骤。
  4. 让电极平衡 ~10 分钟。
    注意：该程序也可以在此步骤中暂停并稍后恢复，因为电极可能储存在 diH2O 中。
  5. 当电极平衡时，打开计算机工作站上的软件（红色图标）。在“设置”选项卡下，确保选中微电极旁边的框，表示它已正确连接并被软件识别。单击窗口左上角的 Start Experiment 并输入所需的文件名和目标。在 传感器校准和实验设置 窗口中，点击 清除所有点 以准备软件进行新的校准。
  6. 用 pH 4.01 和 pH 9.21 校准缓冲液填充两个 50 mL 锥形管 2/3。用精细的实验室抹布轻轻吸干保护管和参比电极擦干。
  7. 从 pH 4.01 缓冲液中的电极开始，输入 4.01 作为已知 pH 值。mV 读数稳定后，选择 添加点。确认信号在 ~380 mV 时稳定。添加点后，将两个电极放回 diH2O 中冲洗，然后再次吸干。
  8. 使用 9.21 缓冲区重复上一步，并在信号稳定 （~83 mV） 时单击 添加点 。检查微电极在 pH 4.01 和 9.21 之间是否线性响应;因此，只需要两点校准曲线。确保这些点之间的结果线具有 50-70 mV/pH 单位的负斜率。点击 保存并使用校准。
    注意： 您现在可以开始记录测量值30。

3. 人胃类器官的 pH 值分析

注意： 以下协议针对惯用右手的用户进行了描述。注意： 禁用 PC 上的所有省电选项，因为如果 PC 进入睡眠模式，正在进行的测量将中断。

  1. 在立体显微镜的左侧组装一个带夹子的环形支架，以固定参比电极。将连接到重型实验室支架的显微操作器放在显微镜的右侧（图 1A）。
  2. 小心地将微电极从保护盒中取出，将其平放在工作台上，然后快速、快速地将保护壳拉下。
    注意：微电极非常脆弱，应小心确保尖端不会接触坚硬的固体材料。为获得最佳结果，请在坚固的工作台上进行测量，避免使用可能导致工作台振动或电极意外移动的设备。
  3. 将微电极安装在显微操作器上，并布置立体镜和显微操作器，使微电极可以向培养皿推进，而不会撞击物镜或显微镜的其他部分。
  4. 放置包含类器官的培养皿，以充分可视化要分析的第一个类器官（图 1B）。
  5. 将参比电极轻轻固定到立体镜左侧环形支架上的夹子上。放置参比电极，使其位于 ECM 周围的介质中。注意确保它不会破坏类器官，因为载物台在测量之间移动。
  6. 直接观察培养板（而不是显微镜），推进微电极的尖端，直到它充分浸没在介质中。在软件的 Data logger 选项卡下，单击 Start 开始 按钮（指向右侧的单个三角形）开始记录。确保选中屏幕右侧的 Calibrated 复选框。
    注意： 在前进到下一个区域之前，每个读数需要 ~10 秒才能稳定下来。
  7. 在进入 ECM 之前，请确保电极尖端在显微镜下可见，并且其位置为向第一个感兴趣的类器官线性推进。将电极缓慢推进到凝胶中，不要与任何类器官接触。记录至少三个 pH 读数并计算平均值。
  8. 定位微电极，使其准备好沿垂直于表面的轴向第一个感兴趣的类器官前进。让电极在上皮表面做一个小的压痕而不穿透（图 1C）。
    注意：此步骤还将深入了解类器官是否会保持在原位，或者它是否可以在 ECM 中更自由地移动。
  9. 通过一个快速的动作，将微电极推进到类器官中。如果类器官围绕微电极移动或远离，请尝试稍微不同的角度，或将其靠在另一个类器官或培养皿盖玻片底部周围的塑料边缘上。在每种实验条件下测量 10 种不同类器官的管腔 pH 值（三次）。记录完测量值后，单击方形 Stop 按钮。
    注意：估计类器官的直径，以决定将电极推进到类器官管腔中的程度，注意不要刺穿它。为了提高准确性，请使用显微镜的相机软件（如果有）测量直径。注：如果在一次或多次测量后微电极尖端明显沾满碎屑，请在细胞解离溶液、PBS、EtOH 中清洗微电极，然后在继续之前用 diH2O 清洗。

4. 电动仿形（可选）

注意：此选项需要安装在机械电机平台上的显微操纵器，该微操纵器最终由计算机软件通过电机控制器31 进行控制。

  1. 打开 Profiling 软件（棕色图标），然后在 Profiling 选项卡下启动新实验。
  2. 当电机设备正确连接时，z 轴的设置将自动识别 电机 。
    注意：使用此设置，仍可手动控制 x 和 y 方向的移动。
  3. 找到 Profile interaction 选项卡30。在 开始之前，确保可以快速过渡到观察显微镜目镜，以确保类器官以所需的距离进入。转到 Profile settings 并执行以下操作：
    1. 指示 Start distance 为 0 μm。
      注意：如果上皮壳对给定的类器官特别坚韧，则类器官可能会被推开或变形，而不是被穿透。如果是推动情况，请继续推进电极，但请注意进入发生的点，因为软件无法自动记录。
    2. 判断被分析的类器官的大小，指示 End 距离 不超过类器官估计直径的 3/4。
      注意：此特定步骤旨在防止损坏电极尖端。
    3. 指示所需的 步长 — 100 μm，如图 2E 所示。确保最小步长与电极尖端的尺寸相匹配（例如，25 μm pH-25 电极尖端为 25 μm）。
    4. 指示电机将电极尖端返回到 轮廓之间的安全 位置。
      注意：这应该是样品上方（类器官外）的舒适高度，可以使用手动显微操作器在 x 和 y 方向上安全地向侧面移动传感器。将 Sensor angle （传感器角度 ） 保留为默认设置。
    5. 要使电极平衡，请在 Wait before measure（s） （等待测量） 下指示至少 3 秒。
    6. 将 Measure period（s） （测量周期） 设置为至少 1 秒。在此期间的测量值将被平均。
      注意：如果在电噪声较高的环境中进行测量，则指示更长的时间可能会有所帮助。
    7. 将 Delay between（s） 设置为至少 1 秒。
    8. 设置在每个深度测量的首选仿 行 数。
    9. 点击 开始 Start 开始 按钮。

5. 电极的清洁

  1. 将要清洁的电极放回其保护管中。
  2. 测量后用 diH2O 冲洗电极。
  3. 用 70% 乙醇冲洗电极几分钟。
  4. 用 pH 4.01 缓冲液冲洗电极。
  5. 在继续测量之前，用 diH2O 再次冲洗电极。

6. 电极的储存

注意：两个电极均应在室温下存放在低活性位置，以防止意外损坏。

  1. 使用 pH 微电极后，小心地将其水平滑回保护管中（沿实验室工作台滑动以获得水平支撑）。
  2. 将微电极直立（尖端朝上），轻轻地将无菌水填充到保护管中。用电极随附的塞子塞住保护管。确保保护管上的所有孔都用电工胶带密封。存放在防碎盒中，以备下次使用。
    注意：建议使用电极随附的原包装盒，因为它包含保护插件，旨在将电极在存放时保持在原位。
  3. 将参比电极储存在装有 3M KCl 溶液的烧杯或量筒中。用封口膜盖住烧杯/量筒，以防止溶液蒸发。
    注意：如果使用量筒，建议用胶带将其固定在实验室工作台上，以防止意外移动。

7. 甲基红注射液（可选）

注：甲基红是一种比色指示剂染料，可用于验证微电极测量值。

  1. 用无菌矿物油回填 2 μL 玻璃毛细管，将其加载到显微操作器控制的 nL 自动注射器上，然后用含有 0.02% 甲基红和 150 mM HCl 的溶液填充。
    注：由于 HCl 的酸性，溶液在毛细管中应呈现红色/粉红色。
  2. 用 9.2 μL 溶液25 注入直径至少 300 μm 的类器官。
  3. 使用适用于立体显微镜的相机捕获图像或视频（图 2G）。

结果

酸的分泌是人体胃部的一项重要功能。然而，在类器官中可以在多大程度上模拟酸分泌仍然是一个争论的问题 6,32,33,34。因此，我们开发了上面详述的协议来准确测量胃类器官中的酸产生。值得注意的是，我们使用了在标准扩增条件下培养的未刺激的成体干细胞衍生的类器官，这些类器官已经传代了?...

讨论

对类器官管腔空间的有限访问严重限制了我们对这种微环境的生理动力学的理解。用于管腔生理学功能分析的可靠工具将扩展我们利用类器官作为生理学、药理学和疾病研究的体外模型的能力。类器官是高度可调的、生理相关的模型，具有在人类群体内复制遗传变异的额外潜力。现有的类器官腔内 pH 测量方法使用 pH 敏感染料或纳米颗粒，这些方法通常必须与荧光显微镜或光谱相结合 16,17,3...

披露声明

作者没有需要披露的利益冲突。

致谢

作者要感谢 Ellen Lauchnor 博士、Phil Stewart 博士和 Bengisu Kilic 之前的工作和对 O2 微传感器的帮助;Andy Sebrell 接受类器官培养和显微操作培训;Lexi Burcham 在类器官培养、培养基制备、数据记录和组织方面提供帮助;和 Susy Kohout 博士，提供电生理学的一般建议。我们要感谢Dr. Heidi Smith在成像方面的帮助，并感谢蒙大拿州立大学生物膜工程中心生物成像设施，该设施得到了国家科学基金会MRI计划（2018562）、M.J. Murdock慈善信托基金（202016116）、美国国防部（77369LSRIP和W911NF1910288）以及蒙大拿纳米技术设施（由NSF Grant ECCS-2025391支持的NNCI成员）的资助。

特别感谢使这项工作成为可能的整个 Unisense 团队，尤其是 Andrew Cerskus 博士、Laura Woods 博士、Lars Larsen 博士、Tage Dalsgaard 博士、Line Daugaard 博士、Karen Maegaard 博士和 Mette Gammelgaard。我们研究的资金由美国国立卫生研究院拨款 R01 GM13140801 （D.B.， R.B.） 和 UL1 TR002319 （KNL） 以及蒙大拿州立大学研究和经济发展办公室 （DB） 的研究扩展奖提供。 图 1A 是使用 BioRender 创建的。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
3 M KClUnisense
5 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, SterileCellTreat229091B
10 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, SterileCellTreat229092B
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, SterileCellTreat229412
24 Well Tissue Culture Plate, SterileCellTreat229124
25 mL Wobble-not Serological Pipet, Individually Wrapped, Paper/Plastic, Bag, SterileCellTreat229093B
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | UncoatedMatTekP35G-1.5-20-C
50 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, SterileCellTreat229422
70% EthanolBP82031GALBP82031GAL
70 μm Cell Strainer, Individually Wrapped, SterileCellTreat229483 
1,000 µL Extended Length Low Retention Pipette Tips, Racked, SterileCellTreat229037
Amphotericin B (Fungizone) SolutionHyClone Laboratories, IncSV30078.01
Biosafety CabinetNuaire NU-425-600Class II Type A/B3
Bovine Serum AlbuminFisher BioreagentsBP1605-100
Cell recovery solutionCorning354253Cell dissociation solution
DMEM/F-12 (Advanced DMEM)Gibco12-491-015
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)Fisher Scientific15017CV
Fetal Bovine SerumHyClone Laboratories, IncSH30088
G418 SulfateCorning30-234-CR
Gentamycin sulfateIBI ScientificIB02030
HEPES, Free AcidCytivaSH30237.01
HP Pavillion 2-in-1 14" Laptop Intel Core i3HPM03840-001
Hydrochloric acidFisher ScientificA144C-212
IncubatorFisher Scientific11676604
iPhone 12 cameraApple
L-glutamineCytivaSH3003401
Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-PlyFisher Scientific34133
M 205 FA StereomicroscopeLeica
Matrigel Membrane Matrix 354234CorningCB-40234
MC-1 UniMotor ControllerUnisense
Methyl red
MM33 MicromanipulatorMarzhauser Wetzlar61-42-113-0000Right handed
MS-15 Motorized StageUnisense
Nanoject-IIDrummond3-000-204nanoliter autoinjector
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15-140-148
pH MicroelectrodesUnisense50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160SensorTrace software is not compatible with Apple computers
Reference ElectrodeUnisenseREF-RM-001652SensorTrace software is not compatible with Apple computers
SB 431542Tocris Bioscience16-141-0
Smartphone Camera AdapterGosky
Specifications Laboratory Stand LSUnisenseLS-009238
Trypsin-EDTA 0.025%, phenol redGibco25-200-056
UniAmpUnisense11632
United Biosystems Inc MINI CELL SCRAPERS 200/PKFisherMCS-200
Y-27632 dihydrochlorideTocris Bioscience12-541-0
µSensor Calibration KitUnisense/ Mettler Toledo51-305-070, 51-302-069pH 4.01 and 9.21, 20 mL packets

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