在体外通过间充质干细胞和视网膜色素上皮之间的隧道纳米管进行线粒体转移

摘要

在这里，我们提出了一种方案，包括线粒体示踪、间充质干细胞 （MSC） 和视网膜色素上皮细胞 （ARPE19） 的直接共培养程序，以及观察和统计分析隧道纳米管 （TNT） 形成和线粒体转移的方法，以表征通过 TNT 在 MSC 和 ARPE19 细胞之间交换的线粒体交换。

摘要

线粒体转移是一种正常的生理现象，广泛发生在各种类型的细胞中。在迄今为止的研究中，线粒体运输的最重要途径是通过隧道纳米管 （TNT）。有许多研究报道称，间充质干细胞 （MSC） 可以通过 TNT 将线粒体转移到其他细胞。然而，很少有研究证明双向线粒体转移的现象。在这里，我们的方案描述了一种实验方法，通过两种线粒体示踪方法 在体外 研究 MSC 和视网膜色素上皮细胞之间的线粒体转移现象。

我们将 mito-GFP 转染的 MSC 与 mito-RFP 转染的 ARPE19 细胞 （一种视网膜色素上皮细胞系） 共培养 24 小时。然后，所有细胞都用鬼笔环肽染色并通过共聚焦显微镜成像。我们在 ARPE19 细胞中观察到具有绿色荧光的线粒体，在 MSCs 中观察到具有红色荧光的线粒体，表明线粒体双向转移发生在 MSCs 和 ARPE19 细胞之间。这种现象表明线粒体转运是一种正常的生理现象，也发生在 MSC 和 ARPE19 细胞之间，线粒体从 MSC 转移到 ARPE19 细胞比 反之发生频率高得多。我们的结果表明，MSCs 可以将线粒体转移到视网膜色素上皮中，同样预测 MSCs 将来可以通过线粒体转运在视网膜色素上皮中发挥其治疗潜力。此外，线粒体从 ARPE19 细胞转移到 MSC 仍有待进一步探索。

引言

线粒体是大多数细胞类型的主要能量来源，线粒体功能障碍尤其影响视网膜¹ 等高能量需求组织。视网膜中的代谢改变可引发生物能量危象，最终导致光感受器和/或 RPE 细胞死亡²。基于间充质干细胞 （MSC） 的疗法已被证明对治疗眼部变性有效，MSC 对视网膜组织有益影响的确切机制之一可能归因于功能性线粒体转移 3,4,5,6。2004 年，Rustom 等人首次报道了通过隧道纳米管 （TNT） 促进的新型细胞间相互作用进行线粒体转移^的现象7。

在 2D 培养中，隧道纳米管 （TNT） 通过其长度从数十纳米到数百纳米不等的薄 （20-700 nm） 膜突起来识别，这些突起悬浮在基质上，可以直接在两个或多个同型和异型细胞之间建立连接。这些结构显著富含 F-肌动蛋白，并促进细胞之间货物（如线粒体）的运输。此外，TNT 的两端都有开口，使互连细胞之间的细胞质内容物保持连续性⁸。

研究方案

1. MSC-mito-GFP 和 ARPE19-mito-RFP 细胞系的生成

1. 细胞培养
   注意：此处仅以 MSC 为例。
   1. 在含有 1% 青霉素和链霉素的 hMSC 培养基中的 6 孔板中培养人 MSC（参见 材料表），直至细胞密度达到 80%-90%。根据细胞生长的密度，每 2-3 天更换一次培养基。
      1. 去除原始培养基，并用磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 洗涤细胞一次（参见 材料表）。加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA-DPBS 混合物（0.05% 胰蛋白酶-EDTA：0.25% 胰蛋白酶-EDTA 用 DPBS 以 1：5 的比例稀释;参见 材料表），并在 37 °C 培养箱中孵育 3-4 分钟（取决于细胞）。
         注：在显微镜下观察细胞消化过程，如果大多数细胞呈圆形和分离，则停止消化。
      2. 轻轻敲击 6 孔板以分离粘附在表面的细胞，然后加入 1 mL 新鲜完全培养基以终止消化。
      3. 用移液枪轻轻重悬所有细胞，然后将所有收集的细胞转移到 15 mL 离心管中。
      4. 将细胞以 200 × g 离心 5 分钟。
      5. 吸出上清液，并加入 1 mL 新鲜培养基重悬细胞。取 10 μL 细....

讨论

大量研究表明，TNT 介导的线粒体转移现象是各种类型组织细胞中普遍存在的生理过程 10,11,12,13。MSC 向线粒体功能障碍细胞的功能性线粒体捐赠具有很强的治疗潜力 3,14,15,16,17,18。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
6-well plate	NEST	703001
15 mL centrifuge tube	BD Falcon	352097
24-well plate	NEST	702001
ARPE19 cells	ATCC	CRL-2302	Cell lines
Bovine serum albumin (BSA)	Beyotime	ST025
CellTrace violet	Invitrogen	C34557
Cover slide	NEST	801007
DMSO	sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	VivaCell	C04002-500
FluorSave Reagent	Millipore	345789
MSCs	Nuwacell	RC02003	Cell lines
ncMission	Shownin	RP02010
Pen Strep	Gibco	15140-122
pCT-Mito-GFP	SBI	CYTO102-PA-1	Plasmid; From  https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv
Puromycin	MCE	HY-B1743A
Pipette	Axygen	TF-1000-R-S
Phalloidin	Invitrogen	A22287
Triton X-100	Solarbio	T8200
Transwell plate	Corning	3470