在体外通过间充质干细胞和视网膜色素上皮之间的隧道纳米管进行线粒体转移

摘要

在这里，我们提出了一种方案，包括线粒体示踪、间充质干细胞 （MSC） 和视网膜色素上皮细胞 （ARPE19） 的直接共培养程序，以及观察和统计分析隧道纳米管 （TNT） 形成和线粒体转移的方法，以表征通过 TNT 在 MSC 和 ARPE19 细胞之间交换的线粒体交换。

摘要

线粒体转移是一种正常的生理现象，广泛发生在各种类型的细胞中。在迄今为止的研究中，线粒体运输的最重要途径是通过隧道纳米管 （TNT）。有许多研究报道称，间充质干细胞 （MSC） 可以通过 TNT 将线粒体转移到其他细胞。然而，很少有研究证明双向线粒体转移的现象。在这里，我们的方案描述了一种实验方法，通过两种线粒体示踪方法 在体外 研究 MSC 和视网膜色素上皮细胞之间的线粒体转移现象。

我们将 mito-GFP 转染的 MSC 与 mito-RFP 转染的 ARPE19 细胞 （一种视网膜色素上皮细胞系） 共培养 24 小时。然后，所有细胞都用鬼笔环肽染色并通过共聚焦显微镜成像。我们在 ARPE19 细胞中观察到具有绿色荧光的线粒体，在 MSCs 中观察到具有红色荧光的线粒体，表明线粒体双向转移发生在 MSCs 和 ARPE19 细胞之间。这种现象表明线粒体转运是一种正常的生理现象，也发生在 MSC 和 ARPE19 细胞之间，线粒体从 MSC 转移到 ARPE19 细胞比 反之发生频率高得多。我们的结果表明，MSCs 可以将线粒体转移到视网膜色素上皮中，同样预测 MSCs 将来可以通过线粒体转运在视网膜色素上皮中发挥其治疗潜力。此外，线粒体从 ARPE19 细胞转移到 MSC 仍有待进一步探索。

引言

线粒体是大多数细胞类型的主要能量来源，线粒体功能障碍尤其影响视网膜¹ 等高能量需求组织。视网膜中的代谢改变可引发生物能量危象，最终导致光感受器和/或 RPE 细胞死亡²。基于间充质干细胞 （MSC） 的疗法已被证明对治疗眼部变性有效，MSC 对视网膜组织有益影响的确切机制之一可能归因于功能性线粒体转移 3,4,5,6。2004 年，Rustom 等人首次报道了通过隧道纳米管 （TNT） 促进的新型细胞间相互作用进行线粒体转移^的现象7。

在 2D 培养中，隧道纳米管 （TNT） 通过其长度从数十纳米到数百纳米不等的薄 （20-700 nm） 膜突起来识别，这些突起悬浮在基质上，可以直接在两个或多个同型和异型细胞之间建立连接。这些结构显著富含 F-肌动蛋白，并促进细胞之间货物（如线粒体）的运输。此外，TNT 的两端都有开口，使互连细胞之间的细胞质内容物保持连续性⁸。

由于致密的细胞排列和追踪线粒体的挑战，很难在体内检测 TNT 介导的线粒体转移。利用细胞共培养和线粒体示踪技术的体外实验可以观察 TNT 的形成和线粒体转移 ^8,9。我们还观察到了通过在体外共培养 MSC 和视网膜色素上皮细胞的 TNT 介导的线粒体转移现象 ¹⁰。

许多以前的研究只观察到线粒体从 MSC 到其他细胞的单向转移 3,4,5,6。以前，我们还尝试使用分别用 mito-tracker green 和 mito-tracker red 标记的两种细胞来分析双向线粒体转移，但染料的串扰干扰了实验结果。为了更精确地研究线粒体双向转移，我们在这里使用慢病毒转染技术构建了两种具有不同线粒体荧光的细胞系，随后，通过体外直接共培养观察和分析了 TNT 形成和线粒体双向转移的现象。

简而言之，这里描述了如何追踪线粒体、与 ARPE19 细胞共培养 MSC 以及分析 TNT 形成和线粒体转移的分步且可操作的方案。本实验结果证明了 TNT 介导的双向线粒体转移，不仅证明了线粒体转运是一种常见的生理现象，也显示了 MSCs 对视网膜细胞的潜在治疗能力。

研究方案

1. MSC-mito-GFP 和 ARPE19-mito-RFP 细胞系的生成

1. 细胞培养
   注意:此处仅以 MSC 为例。
   1. 在含有 1% 青霉素和链霉素的 hMSC 培养基中的 6 孔板中培养人 MSC（参见 材料表），直至细胞密度达到 80%-90%。根据细胞生长的密度，每 2-3 天更换一次培养基。
      1. 去除原始培养基，并用磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 洗涤细胞一次（参见 材料表）。加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA-DPBS 混合物（0.05% 胰蛋白酶-EDTA:0.25% 胰蛋白酶-EDTA 用 DPBS 以 1:5 的比例稀释;参见 材料表），并在 37 °C 培养箱中孵育 3-4 分钟（取决于细胞）。
         注:在显微镜下观察细胞消化过程，如果大多数细胞呈圆形和分离，则停止消化。
      2. 轻轻敲击 6 孔板以分离粘附在表面的细胞，然后加入 1 mL 新鲜完全培养基以终止消化。
      3. 用移液枪轻轻重悬所有细胞，然后将所有收集的细胞转移到 15 mL 离心管中。
      4. 将细胞以 200 × g 离心 5 分钟。
      5. 吸出上清液，并加入 1 mL 新鲜培养基重悬细胞。取 10 μL 细胞悬液进行细胞计数。
      6. 慢病毒转染前 18 至 24 小时，以每孔 1 × 10⁵ 个细胞的密度接种 MSC 细胞，在 6 孔板中，确保转染时的细胞密度约为 50%。
2. 慢病毒的转染
   注:与慢病毒转染相关的所有操作都需要在生物安全柜中进行。
   1. 第二天用 2 mL 新鲜培养基替换初始培养基，加入 25 μL 慢病毒悬浮液 （5.00E+08 TU/mL） 和佐剂，然后在 37 °C 下孵育。
      注:慢病毒包装由一家公司使用 Mito-GFP （pCT-Mito-copGFP） 质粒进行（参见 材料表 和 补充图 S1）。
   2. 孵育 6 小时后，用 2 mL 新鲜培养基替换含病毒的培养基。继续孵育并每天更换一次培养基。
      注:转染后 48 小时在 MSC 中观察到显著的线粒体荧光表达，在 72 小时时间点进一步增强。
   3. 转染后 2 天，通过在培养基中补充嘌呤霉素 （1 μg/mL） 来筛选成功转染的细胞。同时，向缺乏病毒转染的间充质干细胞中加入等浓度的嘌呤霉素作为对照。
      注:丝裂-GFP 病毒载体经过工程改造，包含嘌呤霉素抗性基因。
   4. 每天更换培养基，引入嘌呤霉素 （1 μg/mL）。在对照组中，在细胞几乎完全死亡时停止添加嘌呤霉素。
      注:培养基不含此浓度的嘌呤霉素。仅当将培养基添加到 6 孔板中时，才需要添加嘌呤霉素。
   5. 在没有嘌呤霉素的情况下继续培养，直到细胞传代并冷冻。将这种类型的细胞命名为 MSC-mito-GFP。
      注意:ARPE19 细胞来源于 ATCC 细胞库，并在含有 10% FBS 和 1% 青霉素和链霉素的 DMEM/F12 中培养（参见 材料表），它们的消化和传代方法与 MSC 相同。质粒 Mito-RFP 由一家公司从 Mito-GFP 修改而来。最后，我们将成功转染的细胞命名为 ARPE19-mito-RFP。

2. MSC 和 ARPE19 细胞直接共培养

注意:在该共培养系统中，MSC-mito-GFP 细胞将用作供体细胞，而 ARPE19-mito-RFP 细胞将用作受体细胞。为了区分供体细胞和受体细胞，我们追踪了受体细胞。

1. 在细胞质膜中用 CellTrace Violet 标记 ARPE19-mito-RFP 细胞（参见 材料表）。
   注:染料 CellTrace violet 的激发和发射波长分别为 405 nm 和 450 nm。
   1. 向一小瓶 CellTrace Violet 试剂中加入 20 μL 二甲基亚砜 （DMSO） 制备 CellTrace Violet（参见 材料表）储备液，并在使用前充分混合。
   2. 将 ARPE19-mito-RFP 细胞生长至 80%-90% 的所需密度。
   3. 在预热 （37 °C） DPBS 中将 CellTrace Violet 储备液稀释至所需的工作浓度 （1:1,000）。这是加载解决方案。
      注:CellTrace Violet 的稀释必须使用 DPBS 进行，不能用培养基代替，因为这会导致非常差的染色结果。
   4. 去除培养基并用 1 mL 的上样溶液替换。将细胞在 37 °C 下孵育 10 分钟。
      注意:如果条件允许，5 分钟后可以在荧光显微镜下观察染色。一旦达到预期结果，就可以终止染色，因为某些细胞可能无法耐受长时间暴露于 DPBS。
   5. 取出上样溶液，用 DPBS 洗涤细胞 2 次，然后更换为 2 mL 新鲜的完全培养基。染色后，将细胞孵育至少 10 分钟，让 CellTrace Violet 进行乙酸盐水解。
      注意:此步骤对于细胞恢复到最佳状态并避免干扰后续实验是必要的。
2. 通过向每个孔中加入 50 μL DPBS 来制备 24 孔板。随后，将盖玻片（指定直径为 15 mm）（参见 材料表）插入板中并使其静置 1 分钟。从孔中取出 DPBS，利用负压确保盖玻片靠近培养皿底部。
3. 如步骤 1.1.1 中所述，用胰蛋白酶消化供体 MSC 和受体 ARPE19 细胞。
4. 细胞计数
   1. 将 10 μL 细胞悬液放在计数板上进行计数。
      注意:如果细胞密度过高，可以用培养基将其稀释 10 倍，然后按上述方法进行。
   2. 在 24 孔板的每孔 500 μL 培养基中接种 10,000 个 MSC 和 10,000 个 ARPE19 细胞。在将细胞添加到 24 孔板之前，先充分混合细胞。如果 MSC 计数为 A/mL，ARPE19 细胞计数为 B/mL，请参见下面显示的计算结果。
      注:对于 4 孔，2 mL 培养基中需要 40,000 个 MSC 和 40,000 个 ARPE19 细胞。
      含有 40,000 个 MSC 的 MSC 悬液体积 （C） = 40,000/A μL
      含有 40,000 个 MSC 的 ARPE19 悬浮液体积 （D） = 40,000/B μL
      用 2 - （C + D） mL 培养基补足至 2 mL。
5. 在显微镜下观察细胞，摇动板直到细胞均匀分布，然后在培养物中孵育 24 小时。

3. MSC 和 ARPE19 细胞在 transwell 系统中的间接共培养

1. 按照步骤 2.1 至 2.4.1 中的说明进行细胞培养、标记、消化和计数。
2. 在 24 孔板的每孔 1 mL 培养基中接种 20,000 个 ARPE19 细胞。
   注意:在本实验中，我们使用了没有标记线粒体的 ARPE19 细胞。
3. 将插入物放入细胞接种的孔中。
4. 每孔将 10,000 个 MSC 接种在上部细胞室的 100 μL 培养基中。
5. 重复步骤 2.5。

4. 细胞骨架染色

注意:在整个实验过程中避光。

1. 从 24 孔板中取出培养基。用 500 μL/孔的 4% 聚甲醛 （PFA） 洗涤所有细胞一次，加入 500 μL 新鲜的 4% PFA，并固定样品 20 分钟。
   注意:transwell 系统的插入物被丢弃。
   注:由于单壁碳纳米管非常脆弱，因此我们直接用 4% PFA 而不是 DPBS 洗涤细胞，以最大限度地保留完整的单壁碳纳米管。
2. 去除固定剂并用 DPBS 洗涤样品 3 x 10 分钟。
3. 加入 500 μL/孔由 0.5% Triton X-100（参见 材料表）和 4% 牛血清白蛋白 （BSA）（参见 材料表）组成的封闭溶液，并在室温下孵育 1 小时。
4. 去除封闭溶液，用 DPBS 洗涤样品 3 x 10 分钟。
5. 鬼笔环肽染色液的制备（见 材料表）
   注:鬼笔环肽的激发和发射分别为 650 nm 和 668 nm。
   1. 通过将样品瓶内容物溶解在 150 μL 无水 DMSO 中来制备储备液，以产生 400x 储备液。
   2. 通过将 400x 储存溶液用 DPBS 稀释至 1x 来制备染色溶液。这是鬼笔环肽染色液。
6. 向每个孔中加入 200 μL 鬼笔环肽染色溶液，并在室温下孵育 1 小时。
7. 回收染色溶液并用 DPBS 洗涤样品 3 x 10 分钟。
   注意:用 DPBS 洗涤细胞时，最好将板放在摇床上。
8. 用注射器针头取出盖玻片，并让其风干。
   注意:最佳状态是在盖玻片上看不到可见液体，但也不是干燥的。
9. 在载玻片上涂抹少量封固剂（参见 材料表），然后小心地翻转载玻片上的盖玻片，以确保介质均匀地涂覆整个表面。用指甲油密封边缘。
   注意: 等待几分钟，让指甲油变干。
10. 立即捕获共聚焦图像或将其转移到切片盒中，并在 4 °C 下短暂储存。
    注意:理想的储存时间为 2 周。如果超过此时间，成像效果可能会变差。

5. 共聚焦成像

注:共聚焦成像根据操作手册进行，可能因显微镜而异。这里我们只给出一些关键步骤。

1. 启动共聚焦显微镜，并根据操作手册打开四个激光通道（405、488、561、640）。
2. 在计算机上访问软件并执行软件的初步参数化。
   1. 在 "工艺管理 "面板中添加荧光通道 CF-405、CF-488、CF-561 和 CF-640。
   2. 在相机控制面板中，将每个荧光通道的曝光时间调整为 200 毫秒，并将增益强度设置为 2。
   3. 将 laser/LED combiner （激光/LED 耦合器 ） 调整为 80 值。
3. 操作显微镜的外部控制面板，将物镜调整到 20 倍 的放大倍率，并确保将镜头定位在最低设置。
4. 将载玻片倒置在载具台上。
5. 激活 405 nm 激光器并使用粗调和细调焦螺旋调整焦点。观察目镜下方的样品，直到看到蓝色荧光细胞。
6. 在计算机的软件界面中选择 实时成像 ，切换到 CF-405 通道，然后重新调整微调螺旋，直到在计算机屏幕上看到显示蓝色荧光的细胞的清晰图像。
7. 将物镜调整到 40 倍放大倍率并过渡到 CF-640 通道，然后小心调整焦距，直到看到明显的细胞微丝结构。
8. 保持恒定焦距，依次过渡到 CF-405、CF-488 和 CF-561 通道，并根据需要修改最佳 曝光时间、增益强度和每个通道内成像的 激光/LED 耦合器 参数。
9. 激活 Z 图像堆栈 功能，并通过操纵焦距来定义 Z 轴的起点和终点，以使用 Z 轴捕获具有深度的图像。
10. 单击 Start 开始 按钮 流程 管理 面板拍摄照片。
11. 为每个切片随机选择 10 个视野。
    注意:任何两个视野之间都不应重叠。
12. 激活延时功能，在确定所需视野后指定总成像持续时间为 24 小时和 5 分钟的照片间隔。
    注:为了捕获延时序列，有必要将细胞接种在玻璃底培养皿中，并将它们放置在含有 5% CO₂ 气体的通风箱中。
13. 保存并导出所有图像。
    注意:为了加强对 TNT 和线粒体转移的审查，采用了超分辨率成像。使用公司提供的商业化 HIS-SIM（称为 HIS-SIM（高智能和灵敏 SIM））进行超分辨率成像。使用 100 倍/1.5 NA 油浸物镜采集图像。

6. 数据分析

1. 对于每张图像的统计分析，量化细胞总数、纳米管数量、紫色阳性 ARPE19-mito-RFE 细胞数量、显示绿色荧光的紫色阳性细胞数量（代表线粒体转移自 MSC 的 ARPE19 细胞数量）和显示红色荧光的紫色阴性细胞数量（代表线粒体转移自 ARPE19 细胞的 MSC 细胞数量）。
   1. 为了量化 TNT 的形成，计算细胞间纳米管的数量与细胞总数的比率。
   2. 计算线粒体转移速率为显示绿色荧光的紫色阳性细胞数与紫色阳性细胞总数（代表线粒体从 MSC 到 ARPE19 细胞的转移）的比率或显示红色荧光的紫色阴性细胞数与紫色阴性细胞总数的比值（代表线粒体从 ARPE19 细胞转移到 MSCs）。

结果

间充质干细胞 （MSC） 和 ARPE19 细胞直接共培养的示意图如图 1 所示。以 1:1 的比例共培养以表达 mito-GFP 为供体细胞的 MSC 和以紫色标记的细胞质膜为受体细胞的 ARPE19-mito-RFP 细胞。共培养 24 小时后，对细胞进行鬼笔环肽染色，并使用共聚焦显微镜检查。所得细胞群包括 MSC-mito-GFP 细胞、ARPE19-mito-RFP 细胞、含有 mito-GFP 的 ARPE19-mito-RFP 细胞和含有 mito-RFP...

讨论

大量研究表明，TNT 介导的线粒体转移现象是各种类型组织细胞中普遍存在的生理过程 10,11,12,13。MSC 向线粒体功能障碍细胞的功能性线粒体捐赠具有很强的治疗潜力 3,14,15,16,17,18。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
6-well plate	NEST	703001
15 mL centrifuge tube	BD Falcon	352097
24-well plate	NEST	702001
ARPE19 cells	ATCC	CRL-2302	Cell lines
Bovine serum albumin (BSA)	Beyotime	ST025
CellTrace violet	Invitrogen	C34557
Cover slide	NEST	801007
DMSO	sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	VivaCell	C04002-500
FluorSave Reagent	Millipore	345789
MSCs	Nuwacell	RC02003	Cell lines
ncMission	Shownin	RP02010
Pen Strep	Gibco	15140-122
pCT-Mito-GFP	SBI	CYTO102-PA-1	Plasmid; From  https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv
Puromycin	MCE	HY-B1743A
Pipette	Axygen	TF-1000-R-S
Phalloidin	Invitrogen	A22287
Triton X-100	Solarbio	T8200
Transwell plate	Corning	3470