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摘要

本方案描述了一种鼻内施用 α-突触核蛋白聚集体的方法。该方法提供了对帕金森病中 α-突触核蛋白从嗅粘膜到嗅球传播的见解。

摘要

帕金森病 （PD） 是一种神经退行性疾病，其特征是存在路易小体，路易小体是 α-突触核蛋白 （α-Syn） 的聚集体。最近，有人提出该疾病是通过 α-Syn 聚集体从嗅球 （OB） 或迷走神经背核的朊病毒样传播而发展和进展的。尽管 OB 中 α-Syn 聚集体的来源尚不清楚，但最近有人提出它们从嗅粘膜传播。我们之前表明，小鼠模型中 α-Syn 聚集体的鼻内给药诱导了小鼠 OB 中的 α-Syn 病理。在这项研究中，我们提出了一种鼻内施用 α-Syn 聚集体的方法，该方法在小鼠的 OB 中诱导 α-Syn 病理。α-Syn 聚集体的鼻内给药是一种非常简单明了的方法，我们相信它将成为阐明 OB 中 α-Syn 病理起源以及 α-Syn 通过嗅觉系统传播途径的有用工具。

引言

帕金森病 （PD） 的特征是运动迟缓、静止性震颤和肌肉僵硬等运动症状，是第二常见的神经退行性疾病1。PD 还表现为非运动症状，包括嗅觉功能障碍、认知障碍、抑郁、幻觉、便秘和直立性低血压。其病理特征是黑质中的多巴胺能细胞死亡和α-突触核蛋白 （α-Syn） 聚集体的存在，称为路易小体2。

值得注意的是，α-Syn 是一种 140 个氨基酸的蛋白质，在正常条件下以可溶性单体（或四聚体）的形式存在。然而，在异常条件下，可溶性单体会转化为不溶性高分子量聚集体，包括低聚物和原纤维。据报道，α-Syn 向寡聚体和原纤维的转变与细胞毒性有关3。

最近的研究表明，α-Syn 聚集体在神经元之间呈朊病毒样传播。基于大量尸检，Braak 等人在 2003 年提出了路易体病理学以某种刻板方式在大脑中逐渐扩散的假设（Braak 假说）4,5。2008 年，对接受胎儿中脑移植的 PD 患者进行尸检，发现源自胎儿组织的多巴胺能神经元中存在路易体 6,7。这些研究表明，α-Syn 聚集体可以从患病的大脑扩散到移植物，支持 Braak 的假设。

根据这些观察结果，涉及原代神经元培养和小鼠脑内注射 α-Syn 聚集体的实验再现了路易体样聚集体的传播，为 α-Syn 以朊病毒样方式繁殖提供了进一步的证据 8,9。

Braak 等人表明，PD 中的路易体病变始于嗅球 （OB） 和/或迷走神经背核 （dmX）4。根据 Braak 的假设，几项研究报道了将 PD 大脑中的 α-Syn 聚集体或路易体提取物注入实验动物的 OB 和胃肠道 10,11,12。2018 年，一项研究表明，将 α-Syn 聚集体施用到野生型小鼠的 OB 中会诱导 α-Syn 病理沿嗅觉通路传播，导致嗅觉功能障碍13。我们之前将 α-Syn 聚集体接种到 α-Syn 转基因小鼠的 OB 中，发现这会导致海马萎缩和记忆障碍14。

2022 年，我们将 α-Syn 聚集体接种到狨猴（一种小型非人灵长类动物）的 OB 中;这导致 α-Syn 病理学沿嗅觉途径传播、OB 萎缩和广泛的脑葡萄糖代谢减退10。

但是，如果 α-Syn 聚集体的传播发生在 OB 中，则会出现一个关键问题:α-Syn 聚集体最初是通过哪种机制出现的？Saito 等人之前报道了鼻粘膜中存在路易小体15。使用实时震动诱导转换 （RT-QUIC） 分析在 PD 和多系统萎缩 （MSA） 患者的鼻粘膜中检测到 α-Syn 聚集体的存在16。值得注意的是，分析快速眼动睡眠行为障碍 （RBD） 患者的鼻粘膜样本，这被认为是 PD 的前驱阶段，显示 α-Syn 水平增加17。这项研究表明，即使在 PD 的前驱期，鼻粘膜中也可能存在 α-Syn 病理。

虽然这些发现表明了从鼻粘膜到 OB 的潜在途径，但支持这种情况的实验证据有限。为了解决这一差距，我们将 α-Syn 聚集体注射到小鼠的鼻腔中，并研究了 α-Syn 病理学从鼻粘膜到 OB 的传播。我们的实验方法表明，野生型小鼠单剂量鼻内给药 α-Syn 聚集体诱导 OB 中的 α-Syn 病理，为从鼻粘膜到 OB 的传播途径提供实验证据。

研究方案

本研究使用 2 月龄的 C57BL/6J 雄性小鼠。所有实验程序均根据国家指南进行。京都大学动物研究委员会对这项研究给予了伦理批准和许可 （MedKyo 23,544）。

1. α-Syn 预制原纤维的鼻内给药

  1. 根据先前报道的方法，在 PBS （4 mg/mL） 中制备小鼠 α-Syn 原纤维溶液11。用透明薄膜包裹试管以防止污染。
  2. 使用水浴式超声仪对 200 μL α-Syn 原纤维溶液进行超声处理，以生成 α-Syn 预制原纤维 （PFF）（材料表）。在超声波浴中装满水，加入冰块冷却至 4 °C 进行超声处理。对原纤维进行超声处理总共 5 分钟，每个循环包括 30 秒的超声处理，然后是 30 秒的间隔（总共五个循环）。
    注意: 使用个人防护设备，如一次性手套、口罩和安全护目镜，以防止 α-Syn 接触。
  3. 准备带有 10 μL 移液器吸头的 P10 移液器（材料表）。通过腹膜内 （ip） 注射盐酸美托咪定、咪达唑仑和布托啡诺 （MMB） 的组合麻醉每只小鼠。MMB 联合麻醉剂含有咪达唑仑 （0.3 mg/kg）、美托咪定 （4 mg/kg） 和酒石酸布托啡诺 （5 mg/kg）。当混合咪达唑仑 （1 mg/mL） 0.3 mL、美托咪定 （5 mg/mL） 0.8 mL、酒石酸布托啡诺 （5 mg/mL） 1 mL 和生理盐水 2.9 mL 时，腹腔注射使用 0.005 mL/g。
  4. 等待 10 分钟以确保小鼠完全麻醉。如果小鼠处于侧卧状态并且无法自行扶正，则可以确认适当的麻醉。麻醉后，使用无菌棉涂抹器涂抹眼药膏，以防止眼睛干燥。
    注意:在没有麻醉的情况下，当给予鼻腔剂量时，很难保持小鼠仰卧并在小鼠打喷嚏时正确施用 α-Syn 溶液。由于这些原因，镇静是必要的。
  5. 将麻醉的鼠标置于仰卧位。将纸巾或类似材料放在身体下方，确保头部略微向下倾斜（图 1A、B）。这种定位可以防止给药的 α-Syn 溶液迅速流入肺部或食道，从而促进其滞留在鼻腔中。鼻孔如图 1C 所示。
  6. 将 1 μL α-Syn 溶液 （4 mg/mL） 吸入 P10 移液器中，并将移液器吸头放在小鼠鼻子附近。慢慢形成一个圆形液滴并将其保持在移液器吸头的末端（图 1D，红色箭头）。鼻内给药用于单侧鼻孔，使用对侧作为对照侧。
  7. 将滴剂靠近小鼠鼻孔的一侧，让小鼠自然吸入。观察吸入并等待 30 秒到 1 分钟（图 1E）。
  8. 重复步骤 1.6.-1.7。直到施用总体积为 20 μL 的 α-Syn 溶液。完成所有程序后，如果表面被 α-Syn 污染，请丢弃手套并用商用清洁剂擦拭长凳
    注意:整个过程应在安全柜中进行，以防止执行该程序的人员吸入 α-Syn 原纤维。之前的报告表明，25 μL 的体积是鼻到脑给药最有效的18。在本研究中，我们使用相似体积的 20 μL。我们还使用与上一份报告10 中注射到 OB 中的 PFF 浓度相同的 PFF，接近 400 μM （5.6 mg/mL） 的 PFF19。
  9. 给予阿替美唑（3 mg/kg; 材料表）通过腹腔注射逆转美托咪定并促进恢复。当混合阿替美唑 （5 mg/mL） 0.6 mL 和盐水 4.4 mL 时，通过腹腔注射使用 0.005 mL/g。
    注意:提供镇痛，因为尚不完全了解鼻内给药 α-Syn 的压力有多大。
  10. 在鼠标恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前，不要让鼠标无人看管。完全恢复后，将鼠标放回笼子里。

2. 样品制备

  1. 在鼻内施用 α-Syn 预制原纤维后 1,3,6 和 12 个月处死治疗小鼠。
    1. 将小鼠放入诱导箱中，施用七氟烷 （>6.5%） 并继续直到呼吸停止> 60 秒。取出小鼠并通过右心房切口进行快速放血，以确保安乐死。
  2. 将 25G 针头（材料表）插入心尖。以 4 mL/min 的速度用 15 mL PBS 灌注小鼠，然后在 PBS 中灌注 15 mL 4% PFA。
  3. 用剪刀剪掉头部，然后用手术刀在头皮上切开 2 厘米。用剪刀在从底部到鼻子的外侧切开颅骨（图 2A，B）。要获得 OBs，请完全去除 OBs 上的颅骨（图 2B，黄色圆圈）。
  4. 翻转头部，切断脑神经，然后用镊子小心地取出大脑（图 2C、D）。获得具有完整 OB 的大脑（图 2E）。为了获得完整的 OB，当 OB 附着在颅骨上时，用镊子小心地切割嗅觉神经（图 2D，黄色圆圈）。
  5. 将脑样品放入 PBS 中的 4% PFA 中，在 4 °C 下过夜。 不要将脑样品放置超过 24 小时。
    注意:过度固定会降低免疫组织化学染色。如果需要长期储存，将脑部样品保存在 70% 乙醇或含有 0.1% 叠氮化钠的 PBS 中以保持无菌。

3. OB 的免疫组织化学染色

  1. 如下所述，使用自动组织处理器（材料表）对样品进行石蜡化。
    1. 浸入 70% 乙醇中 120 分钟，然后在 100% 乙醇中浸入 8 次，持续 60 分钟。然后，在 100% 二甲苯中浸泡 3 次，持续 120 分钟。
    2. 在 60 °C 的石蜡中浸泡 120 分钟，然后在 60 °C 的石蜡中浸泡 240 分钟。
  2. 如下所述，将样品包埋在石蜡中。
    1. 将样品在 60 °C 下用模块化组织包埋中心包埋在石蜡中（材料表）。将它们放在冰上冷却。
  3. 用切片机将样品切成 8 μm 厚的切片（材料表）18。
  4. 如下所述执行脱蜡。
    1. 在 100% 二甲苯中浸泡 2 次 5 分钟，然后在 100% 乙醇中浸泡 2 次 3 分钟。
    2. 浸入 70% 乙醇中 3 分钟。在 PBS 中洗涤 3 分钟。
  5. 如下所述进行抗原修复。
    1. 浸入 100% 甲酸中 15 分钟。用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗 2 分钟。
    2. 在 120 °C 下高压灭菌 10 分钟。让它自然冷却。
  6. 在 1% 过氧化氢的甲醇溶液中浸泡 10 分钟。在 PBS 中洗涤 5 分钟。
  7. 在载玻片上加入 500 μL 5% 脱脂牛奶的 PBS 溶液，并在室温下孵育 30 分钟。
  8. 将 500 μL 抗磷酸化 α-Syn 抗体（p-α-Syn，1/10000）的 PBS 溶液放在载玻片上，并在 4 °C 下孵育过夜。 用 PBS 洗涤 2 次，每次 5 分钟。
  9. 与 Universal immuno-peroxidase 聚合物，抗兔（材料表）在 25 °C 下孵育 1 小时。 用 PBS 洗涤 2 次，每次 5 分钟。
  10. 根据制造商的说明，使用 3,3'-二氨基联苯胺 （DAB） 染色试剂盒（材料表）显影 5 分钟。
  11. 浸入苏木精溶液中 1 分钟（材料表）。在流水中脱色 10 分钟。
  12. 如下所述执行安装。
    1. 浸入 70% 乙醇中 5 分钟。浸入 100% 乙醇中 2 次，持续 5 分钟。
    2. 在 100% 二甲苯中浸泡 2 次，持续 5 分钟。使用包埋介质进行安装（材料表）。将 100 μL 包埋培养基涂在载玻片上，并用玻璃盖玻片盖住。
  13. 使用 All-in-One 显微镜以 20 倍和 40 倍放大倍率采集图像（材料表）。

结果

图 3 显示了 OB 中 α-Syn 聚集体的几个示例。在本研究中，我们将 α-Syn 聚集体注射到单侧鼻孔中。两个鼻腔由鼻中隔隔开，每个 OB 分别将嗅觉感觉神经元投射到每个鼻腔。因此，对侧的 OB 可以用作对照。

1 个月和 3 个月后，在治疗侧的 OB 中未观察到 P-α-Syn 病理（图 3A、B）。6 个月和 12 个月?...

讨论

在之前的一项研究中，将 α-Syn 聚集体注入猕猴的鼻腔诱导了多巴胺能细胞的死亡和黑质中的铁沉积，尽管没有观察到 α-Syn 聚集体21。据报道，每天将 A53T 人 α-Syn 聚集体施用到朊病毒启动子 α-Syn 转基因小鼠（M83 小鼠）的鼻腔中 28 天，可诱导小鼠大脑中的 α-Syn 病理和运动症状19,22。在本研究中，我们证明单...

披露声明

作者没有需要披露的利益冲突。

致谢

所有实验均由 Rie Hikawa 支持。我们感谢 Yasuko Matsuzawa 提供的文书工作。这项研究得到了 JSPS KAKENHI （MS， No.JP19K23779、JP20K16493 和 JP20H00663）。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710KEYENCEN/AAll-in-One microscope
Ampicillin Sodium SaltNacalai tesque02739-32
Bioruptor IISonicbioBR2006AWater bath type sonicator.
Butorphanol tartrateMeiji Seika PharmaWAK-52850
Cellulose tubeMISUMIUC20-32-100
DeepWellMaximizerTAITECMBR-022UPShaker
DynaCompetent Cells Zip BL21(DE3)BioDynamics Laboratory Inc.DS255Competent cell
EntellanSigma-Aldrich107961Rapid mounting medium for microscopy
Graefe Extra Fine Forceps Curved SerratedFST11152-10 forceps
Hardened Fine ScissorsFST14090-09scissors
Histofine Simple stain mouse MAX-PO (R)Nichirei Bioscience414341Universal Immuno-peroxidase Polymer, anti-Rabbit
ImageJ ver 1.52pNANAhttps://imagej.net/
innova4200New Brunswick scientific9105085Incubator shaker
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosideNacalai tesque19742-94
LB broth, LennoxNacalai tesque20066-24
Leica EG 1150 HLeica14 0388 86 108Modular Tissue Embedding Center
Leica TP 1020Leica14 0422 85108Automatic Tissue Processor 
MedetomidineFuji Film135-17473
Microm HM325 Rotary MicrotomeThermo Scientific902100
MidazolamMaruishi Seiyaku4987-211-76210-0
New hematoxylin Type GMuto65-9197-38Hematoxylin solution
Normal winged needle for vein D type, 25GTERUMONN2332R25G needle
Optima TLX UltracentrifugeBeckman Couler8043-30-1197Ultracentrifuge
P10 pipetteGilsonFA10002P
ParaffinLeica39601095
paraformaldehydeNacalai tesque30525-89-4
Peroxidase Stain DAB KitNacalai tesque25985-50
Pirece BCA Protein Assay KitsThermo Scientific23225BCA assay
pRK172Addgene#134504Plasmid
Q-Sepharose Fast Flow. cytiva17051001Ion exchange resin

参考文献

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