利用划痕伤口迁移测定和球状体发芽测定在功能和分子水平上研究血管生成

摘要

本研究提出了二维 （2D） 划痕伤口迁移测定和三维 （3D） 球状体发芽测定，以及它们各自的下游分析方法，包括 RNA 提取和免疫细胞化学，作为研究 体外血管生成的合适测定。

摘要

血管生成在体内的生理和病理过程中起着至关重要的作用，包括肿瘤生长或新生血管性眼病。详细了解潜在的分子机制和可靠的筛选模型对于有效靶向疾病和开发新的治疗方案至关重要。已经开发了几种 体外 检测来模拟血管生成，利用受控环境提供的机会在分子水平上阐明血管生成驱动因素并筛选治疗靶点。

本研究介绍了使用人脐静脉内皮细胞 （HUVEC） 在体外 研究血管生成的工作流程。我们详细介绍了利用活细胞成像系统在 2D 环境中测量内皮细胞迁移的划痕伤口迁移测定，以及在胶原蛋白基质提供的 3D 环境中评估内皮细胞发芽的球状体发芽测定。此外，我们概述了样品制备策略，以实现进一步的分子分析，例如转录组学，特别是在 3D 环境中，包括 RNA 提取和免疫细胞化学。总而言之，该框架为科学家提供了一个可靠且多功能的工具集，用于进行 体外 血管生成测定的科学研究。

引言

血管生成是指从预先存在的血管中形成新血管¹，是生理发育和病理状况过程中的关键过程。它对于为高度代谢活跃的组织（如视网膜² 或发育中的中枢神经系统³）以及受损组织⁴ 的愈合提供能量是必不可少的。另一方面，异常的血管生成是许多疾病的基础。实体瘤，如结直肠癌或非小细胞肺癌，通过促进血管生成来促进其生长和必要的能量供应⁵。除了癌症外，糖尿病性视网膜病变或年龄相关性黄斑变性等眼部新生血管疾病是发达国家失明的主要原因，也是由异常血管生长引起的 ^6,7。详细了解潜在的病理机制对于理解如何增强生理性血管生成至关重要，例如，在伤口愈合中，同时更好地控制血管增生性眼病等病理状况。

在细胞水平上，血管内皮细胞在血管生成过程中被各种信号分子激活，从而启动细胞增殖和迁移⁸。细胞随后组织成层次结构，未增殖的尖端细胞在发育中的血管分支的前缘形成丝状伪足⁸。此外，快速增殖的柄细胞跟踪尖端细胞，有助于形成新兴血管。随后，募集其他细胞类型，如周细胞或平滑肌细胞，以进一步稳定新生分支⁹。

为了探索血管内皮细胞水平的分子过程，已经开发了许多 体外 方案，最近还审查了¹⁰。这些检测通常分为两类：更简单但可扩展的 2D 方法和更详细的 3D 方案。在最近的一个项目中，我们对 2D 划痕伤口迁移测定和 3D 球状体发芽测定¹¹ 进行了全面的比较分析，以评估它们的差异程度以及它们模拟血管生成各个方面的能力¹²。

虽然两者都具有可靠且易于实施的优点，但在分子水平上，与体内数据相比，3D 球状体发芽测定在解决血管生成的关键方面是有利的，例如代谢开关或细胞-基质相互作用。由于体外血管生成测定用于评估信号通路¹³ 的血管调节潜力和筛选治疗剂，因此体外结果向体内环境的可转移性至关重要。此外，与体内设置相比，对 RNA 和蛋白质水平进行基于组学的分析以表征响应血管生成过程靶向调节的分子变化的机会仍然是一个重要的好处^14,15。

在本出版物中，我们介绍了通过使用活细胞成像迁移测定和球状体发芽测定来探索血管生成相关问题的关键分析，包括后续的分子分析，如用于转录组学分析的 RNA 测序和蛋白质水平的免疫组织化学。

研究方案

1. HUVEC 细胞培养

注意：在无菌工作条件（无菌工作台）下执行以下所有步骤。

1. 扩展 HUVEC
   1. 对于这两种血管生成测定，使用混合的人脐静脉内皮细胞 （HUVEC） 或人微血管内皮细胞 （HMVEC）。
   2. 在进行分裂之前，在未包被的 T75 培养瓶中，用内皮细胞生长培养基 （EGM） 培养细胞，直到它们达到 90% 汇合。每周更换培养基 3 次。
      注意：为了加快生长，可以每天更换培养基。请勿在第 6 次通道之后使用 HUVEC。该研究在同一代的 HUVEC 运行所有实验时收到了最一致的结果。
2. 拆分 HUVEC
   1. 当 HUVEC 在 T75 培养瓶中达到所需的汇合度时，用 5 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗一次，然后在培养箱中用 0.5% 胰蛋白酶孵育细胞 2 分钟。
      注意：长时间接触胰蛋白酶会损害 HUVEC 功能。
   2. 敲击烧瓶轻轻分离细胞。在倒置相差显微镜下确认成功脱离。
   3. 加入 8 mL EGM，将溶液转移到试管中，然后以 250 x g 离心 3 分钟使细胞沉淀。
   4. 如果需要细胞计数，将细胞重悬于 5 mL EGM 中并使用 Neubauer 室。否则，加入 40 mL EGM 并将其分配到 4 个新鲜的 T75 细胞培养瓶上。

2. 划痕迁移测定

注意：划痕迁移测定需要 3 天才能完成（图 1）。在无菌工作条件（无菌工作台）下执行以下所有步骤。

1. 细胞铺板和饥饿（第 1 天）
   1. 使用专用的 96 孔板进行活细胞成像，每孔在 100 μL EGM 中接种 20,000 个 HUVEC。让细胞在培养箱中沉降 6 小时。
      注意：考虑到供应商和实验室之间血管内皮细胞生长速度的不同，建议优化细胞数量。目标是在第二天开始划痕之前获得完美的单层。过度填充的孔可以改变内皮细胞的行为，例如，通过接触抑制¹⁶，而不完全的单层会极大地阻碍分析。
   2. 用每孔 100 μL EBM 补充 2% FBS 将所有孔饿死过夜。
      注意：小心不要损坏细胞单层，尤其是在使用多通道移液器时。
2. 准备刺激溶液（第 2 天）
   1. 在补充有 2% FBS 的内皮细胞生长基础培养基 （EBM） 中稀释所需物质和对照。对于每个孔，使用 100 μL 溶液。
      注：补充有 2% FBS 的 EBM 用作阴性对照，而 25 ng/mL 的重组人血管内皮生长因子 （VEGF） 可用作阳性对照。使用 96 孔板，建议实验设计最少的技术重复（4 个具有相同条件的孔），但建议使用 8 个以获得最佳结果。在规划布局时，尽量减少潜在的边缘或角落效应。
3. 创建 scratch（第 2 天）
   1. 在显微镜下检查细胞以验证汇合的细胞单层和细胞活力。将 96 孔板置于 96 孔绕线制造工具中，然后按下设备的控制杆产生划痕。在松开控制杆之前，小心地掀开伤口制作工具的盖子，以防止双重划伤。
   2. 使用每孔 200 μL EBM 添加 2% FBS 洗涤所有孔两次。在显微镜下确认碎片已成功清除。
4. 细胞刺激（第 2 天）
   1. 每孔加入 100 μL 制备的刺激或对照溶液。
5. 影像学检查（第 2-3 天）
   1. 使用活细胞成像显微镜提供的自动计划，每小时采集一次图像，最长 24 小时。
      注：为确保良好的图像质量，请在将每个孔转移到装有活细胞成像系统的培养箱后立即扫描每个孔。在培养箱中 30 分钟的适应时间有助于获得更好的图像质量。显微镜软件被编程为每小时为定义的划痕中线的每个孔采集一张图像。
6. 在没有伤口制作工具和活细胞成像仪的情况下，请按照以下步骤操作。
   1. 在 24 孔板中使用移液器吸头以诱导划痕。使用经典细胞培养显微镜以特定间隔拍摄图像。为此，请使用配备精确 x 和 y 跟踪功能的电动显微镜。这可实现自动定位，确保在预定义位置进行一致的图像捕获。
      注意：当需要手动成像时，仅对 T0 以及治疗后的一个时间点“x”小时进行成像是一个可行的选择。在使用 HUVEC 的所述方案中，时间点 T12 （刺激后 12 小时） 是一个有吸引力的时间点，阴性对照和 VEGF 刺激的阳性对照之间有明显的区别。但是，建议每 2 小时或 1 小时运行一次成像的初始时间过程实验，以确定每个实验室中特定实验设置的最佳时间点。
7. 分析（第 3 天）
   1. 活细胞成像显微镜软件可以直接分析采集的图像。定义描述细胞草坪、初始划痕和相对伤口密度区域的掩码。根据对比度差异确定细胞边界。
      注意：使用 HUVEC 进行的实验使用了 1.6 的分割调整、500 μm² 的孔文件、1 像素的调整大小、>500 μm 的面积和偏心率 >0.6。相对于实际图像，对细胞检测参数进行彻底的目视审查是必不可少的。通过优化的配置，该软件会自动计算随时间变化的相对伤口密度 （RWD），并使用技术重复的标准偏差 （SD） 生成相应的时间图。然后，此数据可用于统计分析。

3. 使用 2D 培养细胞提取 RNA

注意：在无菌工作条件（无菌工作台）下执行以下步骤，直到步骤 3.3。

1. 电镀细胞（第 1 天）
   1. 按照 HUVEC 细胞培养方案的步骤 1.2 分离 HUVEC。
   2. 在 12 孔板中每孔接种 50,000 个细胞，每孔 2 mL EGM。
   3. 6 小时后将培养基更换为含有 2% FBS（饥饿培养基）的 EBM，以饥饿过夜。
2. 细胞处理（第 2 天）
   1. 在 EBM 中稀释感兴趣的试剂，并补充 2% FBS。用准备好的稀释液替换饥饿的培养基，并在培养箱中将细胞孵育所需的时间。
3. RNA 提取（第 2-3 天）
   1. 每孔用 750 μL Trizol 裂解细胞，并在定轨振荡器上孵育 10 分钟。
   2. 用 1000 μL 移液器重悬样品几次，然后将它们储存在特定的低结合 RNA 管（体积 1.5 mL）中。储存在 -80 °C。

4. 2D 培养细胞的免疫细胞化学

注意：在无菌工作条件（无菌工作台）下执行所有以下步骤，直到步骤 4.4。

1. 盖玻片的准备
   1. 将 100 个直径为 12 mm 的盖玻片放入 50 mL 管中的 5% 氢氧化钾甲醇溶液中孵育 30 分钟，同时摇动应用溶液。
      注意：这是使盖玻片表面去质子化并改善涂层和培养条件的非常重要的步骤。此时，强烈建议确保盖玻片在培养基内均匀分布，并且不会变干并粘合在一起。
   2. 用软化水清洗盖玻片 30 分钟 4 次。
   3. 洗涤后，将其转移到 70% 异丙基溶液中储存。
2. 盖玻片的涂层
   1. 将盖玻片单独靠在方形培养皿的壁上，以使异丙醇蒸发。
   2. 5 分钟后，将盖玻片转移到 24 孔板中（每孔一个盖玻片）。向每个孔中加入 1 mL 的 10 mg/mL 胶原蛋白 I 的 PBS 溶液，并在 37 °C 下孵育 60 分钟。
   3. 然后，用 PBS 洗涤盖玻片 4-5 次，每次 5 分钟。
3. 培养细胞
   1. 按照 HUVEC 细胞培养方案步骤 1.2 中概述的程序分离 HUVEC。
   2. 在 24 孔板中每孔接种 50,000 个细胞，每孔 2 mL EGM。
   3. 6 小时后，将培养基更换为含有 2% FBS 的 EBM，以使细胞附着在孔上并使细胞饥饿过夜。
   4. 第二天，在 EBM 中稀释感兴趣的试剂，并补充 2% FBS。用准备好的稀释液替换孔中的饥饿溶液，并在培养箱中孵育细胞所需的时间。
4. 固定和阻断
   1. 将细胞培养所需时间，然后用 PBS 洗涤细胞 5 分钟。
   2. 在室温 （RT） 下用 PBS 中的 2% 多聚甲醛 （PFA） 固定细胞 20 分钟。
   3. 用 PBS 洗涤 3-4 次，每次 5 分钟。
   4. 将样品与含有 5% 正常山羊血清 （NGS）、0.1% Triton-X-100 的 PBS 溶液的封闭缓冲液在 RT 下孵育 1 小时。
      注：在此步骤中，必须清洗样品以确保 PFA 被完全去除。根据二抗的来源选择血清的种类。
5. 染色
   1. 将样品在 4 °C 下与一抗一起在封闭缓冲液中孵育过夜。
   2. 第二天，要去除任何未结合的一抗，请用 PBS 洗涤样品 3-4 次，每次 5 分钟。
   3. 随后，将样品在 RT 下与相应的二抗和鬼笔环肽-FITC 一起孵育 1 小时，在封闭缓冲液中一起稀释。
   4. 再洗 3-4 次。
   5. 用一小滴含 DAPI 的封固剂将盖玻片倒置在载玻片上，在黑暗中晾干，并用指甲油密封。将样品储存在 4 °C 的黑暗中。

5. 球状体发芽测定

注意：球体发芽测定需要 3 天才能完成（图 2）。在无菌工作条件（无菌工作台）下执行所有以下步骤，直到步骤 5.7。

1. 在悬滴中生成球体（第 1 天）
   1. 按照 HUVEC 细胞培养方案步骤 1.2 中概述的程序分离 HUVEC。
   2. 将 200,000 个细胞与 8 mL EGM 和 2 mL methocel 原液混合，确保充分混合。请参阅 补充文件 1 了解有关制备 methocel 储备液的说明。
   3. 将 25 μL 液滴分配到一个大的方形培养皿的倒置内表面。轻轻将盖子旋转 180°，并将其放置在细胞培养容器的底部，使液滴悬垂。将容器置于细胞培养箱中过夜。
2. 准备胶原蛋白凝胶（第 2 天）
   1. 将 2.3 mL 大鼠尾胶原 I 型与 0.280 mL 10x 培养基 199 充分混合，直到混合物获得始终均匀的黄色调。在整个过程中将这种混合物放在冰上。
3. 滴定胶原凝胶（第 2 天）
   1. 使用 NaOH （2 N） 滴定混合物以达到生理 pH 值，以橙色表示。
   2. 向最终产品中加入 50 μL HEPES 缓冲液。
      注：为确保测定的最佳动态范围，必须尽可能接近生理 pH 值。不同批次的胶原蛋白可能需要不同量的 NaOH。在整个过程中，将混合物严格放在冰上，并始终均匀混合。
4. 收获球体（第 2 天）
   1. 用 20 mL PBS 冲洗细胞培养盖上的悬挂滴。
   2. 将溶液以 250 x g 离心 7 分钟。弃去上清液，轻轻敲击试管，将球体重悬于 0.1 mL FBS 和 0.4 mL EGM 中。
   3. 加入 2 mL methocel 原液并充分混合。使用最小容量为 5 mL 的移液器，以避免损坏球状体。
5. 将球状体添加到 3D 胶原蛋白基质中（第 2 天）
   1. 将 2 mL 制备好的胶原蛋白混合物添加到重悬的球状体中并充分混合。
   2. 将 0.5 mL 所得混合物分配到 24 孔板的孔中，并在细胞培养箱中孵育 30 分钟。
6. 刺激 3D 胶原蛋白基质中的球状体（第 2 天）
   1. 在 EBM 中制备所需物质的稀释液。对于每个孔，使用 100 μL 溶液。
      注意：EBM 用作阴性对照，而 25 ng/mL（在 500 μL 胶原蛋白基质和 100 μL EBM 层中的终浓度）的血管内皮生长因子 （VEGF） 可用作阳性对照。
   2. 孵育所需的时间。
      注意：在标准测定中，建议使用 18-24 小时，但需要在每个实验室中仔细优化时间。
7. 球体成像（第 3 天）
   1. 利用倒置显微镜和成像平台捕获所有未与孔边缘接触、彼此不接触或显示损坏迹象的球状体的图像。在所有条件下保持一致的设置和缩放级别。
8. 分析（第 3 天）
   1. 利用 ImageJ Fiji 中的测量工具来确定每张图像中每个椭球体的所有芽的长度。
      注意：使用 补充文件 2 中提供的插件，该插件可以提高分析效率并生成输出.txt文件。
   2. 将数据导入电子表格、R 或任何其他首选软件中，并使用每个椭球体的所有芽的平均累积长度作为每个条件的读数。
      注：来自不同凝胶的结果不能以绝对发芽长度的形式合并。在合并数据之前，需要将来自每个处理组的数据归一化为 EBM 或 VEGF 对照组（相对发芽长度）。

6. 使用 3D 培养细胞提取 RNA

1. 球状体发芽测定
   1. 如第 5 节所述进行球状体发芽测定。
2. 胶原蛋白凝胶的裂解
   1. 用温热的 PBS 洗涤球状体凝胶 5 分钟。
   2. 将球状体凝胶切成四分之一，并将所有 4 个四分之一转移到 50 mL 试管中。使用手术刀对凝胶进行机械解剖。
   3. 用裂解液（含 2 mg/mL 胶原酶 D 的 PBS 溶液）处理凝胶样品，并在 37 °C 下在摇床上孵育 45 分钟。
   4. 用补充有 2 mM EDTA 的 PBS 轻轻洗涤凝胶，以终止裂解缓冲液的反应。
3. RNA 提取
   1. 将裂解的凝胶重悬于 750 μL Trizol 中并孵育 10 分钟，以确保如步骤 3.3 中所述的 RNA 提取充分。
   2. 用 1000 μL 移液器重悬样品数次，并将样品转移至特定的低结合 RNA 管（体积 1.5 mL）中。将样品储存在 -80 °C。

7. 3D 胶原基质中球状体的免疫细胞化学

1. 球状体发芽测定
   1. 如第 5 节所述进行球状体发芽测定。
2. 固定和阻断
   1. 用 PBS 中的 4% PFA 固定凝胶 1 小时。
      注：为确保凝胶中的细胞良好固定，用 PBS 冲洗后，需要用手术刀和镊子小心地将凝胶从孔的侧面分离。
   2. 用 PBS 轻轻洗涤凝胶 3-4 次，然后将它们从孔表面完全分离并转移到新的 24 孔板中。
   3. 在定轨振荡器上，将凝胶与 RT 上的封闭溶液（含有 5% NGS 和 0.1% Triton-X-100 的 PBS 溶液）孵育 1 小时。
3. 染色
   1. 将样品在 4 °C 下在轨道振荡器上孵育过夜，并在封闭缓冲液中稀释一抗。
      注：在此孵育过程中转动凝胶并不能提高染色质量。
   2. 第二天，用 PBS 轻轻洗涤凝胶 4-5 次，每次 5 分钟。
   3. 将相应的二抗，在封闭缓冲液中用鬼笔环肽-FITC 稀释，在 4 °C 下在轨道振荡器上孵育过夜。
   4. 用 PBS 进行 4-5 次额外的洗涤步骤。
   5. 将凝胶转移到显微镜载玻片上，并在盖玻片上滴入两滴含 DAPI 的封固剂进行封固，放置在每个凝胶上。在用指甲油密封之前让样品干燥，并将其存放在 4 °C 的黑暗中。
4. 显微术
   1. 在共聚焦显微镜上对所有样品进行成像。使用 20 倍物镜并专注于感兴趣的区域。以 Z 轴堆叠形式采集图像，以及单个焦平面图像。
      注意：在整个 3D 样品的多个截面上获取 Z 堆栈和焦平面图像对于捕获完整的表示至关重要，尤其是对于厚 3D 样品。

8. 人视网膜微血管内皮细胞 （HRMVEC）

注意：所有描述的步骤也可以用微血管内皮细胞进行，例如，人视网膜微血管内皮细胞 （HRMVEC）。在这种情况下，需要将培养基转换为含有 10% 胎牛血清 （FBS） 的特定微血管内皮细胞培养基进行培养以及每次测定中的特定步骤。HRMVEC 与检测方案的特异性差异概述如下：

1. 划痕测定
   1. 在 10% FBS 微血管内皮细胞培养基中培养细胞，而不是 EGM。
   2. 接种 20,000 个细胞/孔。
   3. 不要让细胞饿死过夜。
   4. 进行划痕后，将培养基更换为含有 5% FBS 的基底内皮细胞培养基，而不是含有 2% FBS 的 EBM。
2. 2D 培养的 HRMVEC 的免疫细胞化学
   1. 在 10% 微血管内皮细胞培养基中培养细胞，而不是 EGM。
   2. 不要让细胞饿死过夜。
   3. 在处理前将培养基更换为 EBM + 5% FBS，而不是 EBM+2% FBS。
3. 球状体发芽测定
   1. 用含有 10% FBS 而不是 EGM 的微血管内皮细胞培养基将细胞接种为悬滴。
4. 3D 胶原蛋白基质中球状体的免疫细胞化学
   1. 用含有 10% FBS 而不是 EGM 的微血管内皮细胞培养基将细胞接种为悬滴。

结果

对于迁移测定，彻底检查在 t = 0 h 时间点捕获的图像以确保系统准确检测完全形成的细胞单层的存在至关重要（图 1B）。此外，应确认划痕边界的清晰度和直线度（图 1B）。无细胞区域应该在很大程度上没有碎屑。在测定结束时，例如，用 25 ng/mL VEGF 作为阳性对照刺激的一组应该显示成功迁移到原始划痕区域（图 1B）。技术问题?...

讨论

在本报告中，我们提出了一系列具有功能和分子读数的技术，用于研究 体外血管生成。

迁移测定代表了一种成熟的技术，用于湿实验室工作的所有领域。我们选择了市售的活细胞成像方法，以利用适用于筛选和剂量反应实验的 96 孔格式、由 WoundMaker 工具创建的标准化和可重复的伤口大小、通过延时成像观察迁移动力学的机会长达 24 小时以及自动图像量化软件。然而...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Medium 199	Sigma-Aldrich	M0650
Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure F(ab)‘2-Fragment	Jackson IR	115-606-072
Axio Vert. A1	Zeiss
CapturePro 2.10.0.1	JENOTIK Optical Systems
Collagen Type 1 rat tail	Corning	354236
Collagenase D	Roche	11088858001
Endothelial Cell Basal Medium	Lonza	CC-3156	EBM
Endothelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3162	EGM
Ethylenediaminetetraacetic acid	Serva	11290.02	EDTA
Fetal bovine serum	Bio&SELL	S 0615	FBS
Human Umbilical Vein Endothelial Cells, pooled	Lonza	C2519A	HUVEC
IncuCyte ImageLock 96-well plates	Sartorius	4379
Incucyte S3 Live-Cell Analysis System	Sartorius
Methocel	Sigma	m-0512
Microvascular Endothelial Cell Medium with 10% FBS	PB-MH-100-4090-GFP	PELOBiotech
NaOH	Carl Roth	P031.2
Phalloidin-Fluorescein Isothiocyanate Labeled (0.5 mg/mL Methanol)	Sigma-Aldrich	P5282-.1MG	Phalloidin-FITC
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientfic	14190-094	PBS
Primary Human Retinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Systems	ACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Invitrogen by ThermoFisher Scientific	2260939
QIAzol Lysis Reagent	QIAGEN	79306
recombinant human Vascular Endothelial Growth Factor	PeproTech	100-20	VEGF
Squared petri dish	Greiner	688102
Trizol	Qiagen	79306
Trypsin	PAN-Biotec	P10-024100
VEGF-R2 (monoclonal)	ThermoFisher Scientific Inc.	B.309.4
WoundMaker	Sartorius	4493