使用电喷雾技术合成载有黑籽油、海藻酸盐基的 pH 敏感磁珠

摘要

提出了一种利用高电压和靶向、负载活性成分的乳液来制造 pH 响应、均匀微珠的技术。

摘要

源自 Nigella sativa 植物种子的黑籽油 （BSO） 因其潜在的抗癌特性而受到关注，尤其是在结肠癌的情况下。其活性化合物胸腺醌可能有助于抑制癌细胞生长并诱导结肠癌细胞凋亡。此外，黑籽油的抗炎和抗氧化作用有助于营造更健康的肠道环境，从而有可能降低患癌症的风险。因此，本研究合成了 pH 敏感的藻酸盐珠子，以受控释放方式将 BSO 输送到结肠中，而不会在 pH 1.2（胃）下释放药物，从而在 pH 6.8 时提供明确的释放模式。电喷雾技术的使用使配制小而均匀的微珠变得更加容易，在胃肠道介质中具有更高的溶胀和扩散速率，从而提高了工艺性能。

通过 离体 粘膜粘附强度测试、微珠大小、球形度因子 （SF）、包埋效率 （EE）、扫描电子显微镜 （SEM）、 体外 溶胀行为 （SB） 以及 体外 药物在酸性和缓冲介质中的释放来表征配制的微珠。在本次测试中，所有这些制造的珠子都表现出 0.58 ± 0.01 毫米的适中尺寸和 0.03 ± 0.00 毫米的球形。该制剂 在体外显示出有希望的漂浮和释放特性。由于珠子的累积百分比非常低，油 EE 为 90.13% ± 0.93% 很高，释放研究表明在 pH 6.8 中超过 90%，在胃中具有良好的漂浮性。此外，珠子在整个肠道中均匀分布。该方案中使用的电喷雾方法是可重复的，产生一致的结果。因此，该协议可用于商业化目的的大规模生产。

引言

黑籽，尤其是 BSO，由于其公认的药用特性，多年来一直被用于治疗各种疾病。百里醌可能是 BSO¹ 中发现的最重要的植物化学物质之一。近年来，研究人员研究了胸腺醌在体内和体外的潜在治疗益处，产生了支持使用 BSO 的经验证据。这些研究已证明 BSO 具有抗高血压、抗菌、抗组胺、抗真菌、镇痛、抗糖尿病、降脂和抗炎特性，可用于治疗湿疹、高血压、哮喘、咳嗽、头痛、流感、发烧、抗癌、头晕和活动等症状 ^2,3。

在液体和分散体的小液滴或固体材料颗粒上涂上相对较薄的覆盖物称为微胶囊化。说到油，微胶囊油通常非常有价值，因为某些形式的油，如 BSO，被视为营养食品并提供药用优势⁴。然而，将油直接添加到食物的基质中可能会导致挥发，由于暴露在氧气和紫外线下，这会导致活性迅速消失⁵。此外，缺乏对油的释放速率的控制会导致即时和短暂的影响。通过微胶囊化或微球化在精油周围形成聚合物涂层是克服这些缺点的一种方法⁶.

微胶囊，也称为微球，可保护油免受有害环境条件的影响⁷。该工艺已被广泛用于提高药物疗效、保留药物含量、实现定时释放片剂、改善掩味、减少产品保质期内的风味损失、延长口感以及在单一剂量中分离不相容的成分⁸。微胶囊化还有助于维持代谢吸收、控制油释放速率以及维持适当的浓度以在特定位置产生预期结果⁹。

电流体动力学封装是一种简单且适应性强的方法。活性物质位于微胶囊的内芯中，微胶囊由外壳组成。在这方面，它具有相当强大的基质，以保证活性成分可以更有效地传播，而不是明确定义的细胞核。在球环化之前，活性物质和聚合物溶液必须结合以产生微球⁹。另一方面，由于油具有挥发性，因此对其进行微胶囊化可能非常困难，并且需要仔细控制温度。

封装油的方法多种多样。例如，某些油需要在低温下封装，以防止其生物活性成分分解或挥发。为了创建微米和纳米尺寸的结构，研究人员对电流流体动力学原子化 （EHDA） 进行了广泛的研究¹⁰。从这个意义上说，加工条件，包括流速、施加电压和喷嘴尺寸，以及聚合物溶液的收集距离特性，是产生所需粒度或形态必须考虑的两个主要因素^11,12。

在这项研究中，海藻酸盐——一种适合口服摄入的天然多糖——被用来封装 BSO。棕色海藻含有海藻酸盐，这是一种天然存在的阴离子聚合物。它由两种单体结构组成：α-L-古鲁糖醛酸 （G） 和 1-4βD-甘露糖醛酸 （M）^{酸 13}。它的聚合物无毒¹⁴，具有高度的生物相容性，价格低廉，并且降解有效¹⁵.因此，它经常被用于生物技术和工程领域。

海藻酸盐是通过离子凝胶化封装的首选材料，因为它们可以通过与 Sr²⁺、Ca²⁺ 或 Zn²⁺ 离子等二价阳离子形成离子连接，在各种海藻酸盐链的 G 基团之间形成交联结构。凝胶化过程可以通过蛋盒模型来充分表征，该模型将二价阳离子限制为并排藻酸盐分子上的两个羧基。有人提出，海藻酸钠珠的水凝胶特性可能调节大分子和小分子的释放。由于其粘膜粘附特性，海藻酸钠珠可能会长时间粘附在肠粘膜上。此外，海藻酸盐提供了一个盾牌，可以保护油免受酸性介质¹⁶ 等外部因素的影响，并将油转移到胃肠道的输送通道¹⁷。此后，它被用于研究，以帮助对粘膜组织进行特定部位的药物治疗^18,19。

本研究使用电流体动力学方法来研究乳化商业油以制造胶囊的可行性²⁰。在这里，使用电流体动力学方法生成和分析载有藻酸盐-BSO 的微球²⁰。本研究评估了许多其他因素，包括微球的 SF、 离体、 粘膜粘附特性、EE%、物理外观、尺寸分布和 zeta 电位;衰减全反射傅里叶变换红外 （ATR-FTIR） 光谱用于测试化学相容性²⁰。

研究方案

1. 海藻酸盐-BSO乳液的制备

1. 将 10% w/v BSO 分散在含有 1、3 和 5% w/v 卵磷脂的 1% w/v 海藻酸钠溶液中，溶于 50 mL 烧杯中。
2. 通过使用超声波均质器获得纳米乳液。将 功率 级别设置为 20%。单击 开始 按钮运行均质器 55 秒以完成该过程。

2. 藻酸盐-BSO 乳液的表征

1. 分析 zeta 电位和粒度分布
   1. 在 25 mL 玻璃烧杯中取 0.1 mL 新鲜制备的乳剂，并用 9.9 mL 蒸馏水稀释。
   2. 将 2.5 mL 稀释溶液放入 3 mL 石英比色皿中，然后将比色皿放入测量室中。
   3. 打开盖子，将比色皿放入设备内，确保比色皿相对于光束路径的方向正确。单击 测量 图标。
   4. 取出比色皿。取回样品或妥善处理。
   5. 将数据作为 pdf 文件保存在个人文件夹中以供进一步使用。
2. 测定乳化稳定性 （ES）
   1. 在 10 mL 离心管中取 5 mL 新鲜制备的乳剂。将乳液 （n = 3） 以 894 × g 离心 5 分钟。
   2. 使用公式 （1），根据相分离界面位置确定 ES。
      （1）
      其中 Vemul 是离心后剩余乳化液的体积，Vinitial 是初始乳化液的体积。
3. 微珠制备
   1. BSO 藻酸盐微珠
      1. 使用称为 EHDA 的电喷雾技术制备 BSO 藻酸盐珠。采用由 10% BSO、1% 海藻酸钠和 3% 卵磷脂溶液组成的体积重量 （w/v） BSO 乳液）。
      2. 使用注射泵调节流速，将乳剂装入 10 mL 塑料注射器中，然后将其推入 22 G 针头。将针尖连接到高压电源的正极。
      3. 作为收集器，使用装有 50 mL 1% w/w 氯化钙（胶凝浴）的接地烧杯。在 3、5 和 7 kV 的电压下，在 1 mL/min 和 3 mL/min 之间交替滴落流速，同时保持氯化钙溶液表面上方 10 cm 的距离。
      4. 为了确认完全凝胶化，将珠子留在胶凝浴中 30 分钟，同时搅拌它们。使用不锈钢过滤器从胶凝浴中取出珠子，并用超纯蒸馏水清洗收集的珠子。
      5. 让珠子在室温下在实验室工作台上干燥 16 小时。使用公式 （2） 计算微珠的百分比。
         （2）
   2. 不含 BSO 的藻酸盐珠
      1. 制备 1% w/v 海藻酸钠溶液。向溶液中加入浓度为 1%、3% 和 5% w/v 的卵磷脂。充分混合溶液，直到卵磷脂完全溶解。
      2. 使用步骤 2.3.2.1 中的溶液制备不含 BSO 的藻酸盐珠，如步骤 2.3.1.2-2.3.1.5 中所述。使用公式 （2） 计算产量。

3. 微珠表征

1. 确定大小和形状
   1. 要确定珠子的大小和形状，请使用图像分析仪。使用数码相机拍摄湿珠和干珠子的照片。
   2. 然后，使用仪器预装的比例尺测量珠子直径。使用直径值，使用公式 （3） 从获得的直径值计算 SF：
      SF = （3）
      其中 Dmax 表示穿过拉延筋中心的最大直径（以毫米为单位），而 Dper 是指垂直于 Dmax 并穿过拉延筋中心的直径（以毫米为单位）。
      注意：SF 为零表示理想的球形珠子，增加 SF 值表示与球形的偏差更大。此外，如果珠子的 SF 为 0.05 或更低，则认为珠子是球形的。

4. EE% 的测定

1. 在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中分解珠子，将其返回到乳液中。使用 UV-vis 分光光度计测量所得乳液在 600 nm 处的吸光度。
2. 使用吸光度值表示乳剂的浊度。使用乳剂中已知量的 BSO 创建标准曲线。
3. 使用等式 （4） 计算 EE%：
   （4）

5. 扫描电子显微镜 （SEM）

注：使用 SEM 观察 BSO 藻酸盐珠的微观结构和表面形态。

1. 要检查干珠子的内部，请剪下一些。将切割的珠子点在铝桩上，并使用碳胶带粘贴它们。
2. 在氩气气氛中，在真空蒸发器中用碳溅射模块对珠子进行溅射涂层。为碳涂层应用 100 Å 和 50 Å 的厚度。
3. 使用 10 kV 至 15 kV 的电压加速器在高真空下采集包被珠子的图像。

6. 使用 ATR-FTIR 确定药物-辅料相互作用

1. 使用环境空气作为背景，将仪器波数设置在 4,000 ^cm-1 和 400 ^cm-1 之间，分辨率为 1 ^cm-1。参见补充文件 1。
2. 分别记录 BSO、海藻酸钠、卵磷脂、氯化钙、无 BSO 珠、海藻酸盐-BSO 珠以及活性成分和赋形剂（海藻酸钠、卵磷脂、氯化钙和 BSO）的物理混合物的光谱。
   1. 将样品 （5-10 mg） 放在采样区域。调整 20 次扫描，分辨率 4，测力 80，带平头的压力臂。验证 Auto Increment 是否仍设置为 Blank 选项，以便光谱自动存储在所需的文件夹中。
   2. 要开始样本测量，请单击 [样本] 按钮。选择 [Sample] 后，由于没有等待期，请务必准备好样品并减少压力夹。单独分析所有样品。使用光谱软件单独分析所有记录的光谱。

7. 差示扫描量热法 （DSC）

注：使用 DSC 研究了负载 BSO 的微珠的热特性和相容性（补充文件 1）。

1. 将重达 ~3.20 mg 的珠子密封在普通铝盘中。以 10 °C/min 的速率加热样品，同时在 50-350 °C 的温度范围内，在以 20 L/min 的速率流动的氮气流下进行分析。

8. 珠子的溶胀特性

1. 准备 100 毫克干燥的藻酸盐-BSO 珠子。
2. 在适当大小的干净、干燥的混合容器中制备模拟肠液 （SIF） （SIF） 和模拟胃液 （SGF），大小为 6 L、10 L 或 25 L。将纯净水加入所需体积的约 33% - 2 L、3 L 或 8 L，并将浓缩液瓶的内容物转移到容器中。用纯净水冲洗瓶子，然后将漂洗液和纯净水加入混合容器中，以获得所需的体积;充分混合。测量 pH 值，如果符合规格，则继续进行;如有必要，请调整 pH 值。
3. 将微珠浸入 50 mL 含有模拟肠液 （SIF） 和模拟胃液 （SGF） 的培养基中。在 37 ± 0.5 °C 下保持条件 2 小时。
   1. 取出膨胀的珠子，并以 0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110 和 120 分钟或更长时间的预定间隔通过金属网过滤它们。使用纸巾去除肿胀珠子中多余的液体。
   2. 使用电子分析天平测量擦拭珠的重量。使用公式 （5） 确定溶胀指数的百分比 （%SI）：
      （5）

结果

负载 BSO 的海藻酸盐微珠的制备
图 1 显示了制备负载 BSO 的藻酸盐微珠的实验设置。卵磷脂的用量对 BSO 乳液的稳定性有相当大的影响。用所有三种卵磷脂浓度制成的乳剂相对稳定。本实验采用离心法 （894 × g， 5 min） 评估乳液²⁰ 的稳定性。结果验证了表面活性剂而不是离心对BSO乳液稳定性的影响更大。乳液?...

讨论

使用 EHDA 工艺，制备负载 BSO 的藻酸盐微珠作为 pH 敏感载体。由于羧酸基团的大量存在，磁珠网络表现出 pH 依赖性溶胀和药物释放行为。聚合物链之间强烈的分子间氢键是 pH 值为 1.2 时负载 BSO 的珠子溶胀特性降低的原因。对于 pH 敏感药物给药，负载 BSO 的磁珠可能受益于这种降低的 SB。pH 值对从含有 BSO 的微珠中释放的 BSO 有影响。这些发现表明，负载 BSO 的珠子可能提...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Centrifuge Tubes	Globe Scientific	22-171-624
22 G needle	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	CAD4172
3 mL quartz-cuvette	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	Z276669
50 mL beaker
Aluminum stubs
An electronic analytical balance
ATR-FTIR	Bruker Malaysia Sdn Bhd, Kawasan Perindustrian Temasya, 40150 Shah Alam, Selangor, Malaysia.
Black seed oil	IKOP Pharmaceutical Ltd. (IKOP, Faculty of Pharmacy, IIUM, 25200 Kuantan, Pahang, Malaysia	B182111	Active ingredient
Calcium chloride dehydrate, CaCl2 · 2H2O	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	21074	Gelling agent
Carbon adhesive tapes
Centrifuge
Differential scanning calorimetry
Digital   camera
Grounded beaker
High guluronic acid content Sodium alginate (mw. 97,000) with medium viscosity (40 – 100 mPa s)	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	W201502	Polymer
High voltage power supply
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	W292912	ATR-FTIR cleaning purpose
Lecithin	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	P7568	Surfactant
Microscope
Paper towel
Scanning electron microscopy
Simulated gastric fluid	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	1651	Release media and swelling media
Simulated intestinal fluid	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	84082-64-4	Release media and swelling media
Spectroscopy software
Stainless-steel filter
Syringe pump	SEN JIN SDN BHD Malaysia, Taman Desaria, 46150 Petaling Jaya, Selangor Darul Ehsan Malaysia
Ultrapure distilled water	Supplied by institutional lab
Ultrasonic homogenizer	SEN JIN SDN BHD Malaysia, Taman Desaria, 46150 Petaling Jaya, Selangor Darul Ehsan Malaysia
UV-vis spectrophotometer.
Vacuum evaporator	SEN JIN SDN BHD Malaysia, Taman Desaria, 46150 Petaling Jaya, Selangor Darul Ehsan Malaysia
Voltage accelerator	SEN JIN SDN BHD Malaysia, Taman Desaria, 46150 Petaling Jaya, Selangor Darul Ehsan Malaysia
Zetasizer Nano-ZS	(Malvern Zetasizer Nano series Nano-S and Nano-Z, Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)