逆转录病毒 CRISPR/Cas9 介导的基因靶向在体外研究 Th17 分化

摘要

我们提出了一种将向导 RNA 逆转录病毒转导到 Cas9 转基因小鼠的原代 T 细胞中的方案，为研究 Th17 分化的基因编辑提供了一种有效的替代方案。

摘要

产生 IL-17A 的辅助性 T 细胞（称为 Th17 细胞）在免疫防御中起关键作用，与自身免疫性疾病有关。CD4 T 细胞可以在 体外 用抗原和明确的细胞因子混合物刺激，以模拟 体内 Th17 细胞的分化。使用 体外 Th17 极化测定对 Th17 分化调节机制进行了广泛的研究。

传统的 Th17 极化方法通常涉及从转基因小鼠中获得初始 CD4 T 细胞，以研究特定基因对 Th17 分化和功能的影响。这些方法可能耗时且成本高昂，并且可能受到敲除动物的细胞外源因子的影响。因此，使用向导 RNA 的逆转录病毒转导在 CRISPR/Cas9 敲入原代小鼠 T 细胞中引入基因敲除的方案是一种非常有用的替代方法。本文提出了一种在逆转录病毒介导的基因靶向后将幼稚原代 T 细胞分化为 Th17 细胞的方案，以及用于测定感染和分化效率的后续流式细胞术分析方法。

引言

Th17 细胞是 CD4⁺ T 辅助细胞的一个独特亚群，对于根除细胞外细菌和真菌至关重要，并在各种自身免疫性疾病中发挥重要作用 ^1,2,3。新出现的证据表明，Th17 细胞表现出异质性，在受环境和遗传因素影响的致病性和非致病性条件下发挥作用。阐明控制 Th17 细胞分化、可塑性和异质性的调节过程对于推进更有效的免疫治疗策略至关重要。

转基因动物已被广泛用于揭示 Th17 细胞分化和功能的关键调节因子。使用转基因动物涉及体内完全作，提供其在生理条件或疾病模型中的作用的真实性和系统研究。然而，使用这种方法进行高通量筛选在很大程度上是不切实际的。体外极化测定为研究 Th17 细胞分化提供了一种替代方案。白细胞介素 6 （IL-6） 与转化生长因子 β1 （TGFβ1） 的组合已被证明可促进非致病性 Th17 细胞的发育，而 IL-6、IL-1β 和 IL-23 与驱动致病性 Th17 细胞 （pTh17） 的分化有关^4,5。

研究方案

所有程序均经上海交通大学医学院附属仁济医院实验动物福利伦理委员会批准，并符合机构指南。

1. 逆转录病毒生产

1. 逆转录病毒构建体的制备
   1. 使用 CRISPick 工具 （https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public） 设计用于 RORγt 敲除⁸ 的 sgRNA。指定参考基因组为小鼠 GRCm38，并选择基于 CRISPRko 向导系统的 PAM 序列为 NGG（对于 SpyoCas9，Hsu （2013） tracrRNA）。验证靶基因的名称或其他靶基因格式，并提交有效的输入以获得 sgRNA 候选基因。将其他参数设置为默认值，将 sgRNA 靶标设置为 RORγt（Rorc，基因 ID：19885）以干扰 Th17 的分化，并从小鼠 GeCKO v2 文库中选择非靶向 sgRNA（缩写为 sgNT，序列：GCGAGGTATTCGGCTCCGCG）。

结果

在这项研究中，我们将 sgRNA 靶标克隆到 Rorc 和 sgRNA 非靶向编码序列中，用 mCherry 荧光蛋白克隆到 pMX-U6-MCS 载体中（图 1A、B）。根据 图 2 中概述的方案进行逆转录病毒生产。转染在第 0 天开始，逆转录病毒收获在第 2 天进行。转染效率可以通过 mCherry 荧光强度来测试（

讨论

通过逆转录病毒递送进行 CRISPR/Cas9 基因组编辑是探索辅助性 T 细胞作用的可靠方法。该方案提供了一种快速有效的方法来检查参与 Th17 分化和功能的特定基因。必须仔细遵循几个关键步骤才能获得最佳结果。首先，为了提高基因敲除效率，应仔细选择 gRNA。鉴于 CRISPR/Cas9 基因编辑中存在脱靶效应的风险，谨慎的选择 2-3 个得分高的 gRNA，如方案第 1.1.1 节所述，用于进一步.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Solarbio	E1170
100 mm cell and tissue Culture Dish	BIOFIL	TCD010100
1 M Hepes (Free Acid, sterile)	Solarbio	H1090
24-well cell and tissue culture plate	NEST	702002
48-well cell and tissue culture plate	NEST	748002
Brefeldin A Solution (1,000x)	BioLegend	420601
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD4 Antibody (RM4-5)	BioLegend	100546
CD3e Monoclonal Antibody (145-2C11), Functional Grade, eBioscience	Invitrogen	16-0031-82
CD44 Monoclonal Antibody (IM7), PE, eBioscience	Invitrogen	12-0441-83
CD62L (L-Selectin) Monoclonal Antibody (MEL-14), APC, eBioscience	Invitrogen	17-0621-82
Cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer Auto 2000
Cell Strainer (40 μm)	biosharp	BS-40-CS
Cell Strainer (70 μm)	biosharp	BS-70-CS
Centrifuge	eppendorf	5425 R
Centrifuge	eppendorf	5810 R
ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix	Vazyme	Q411-02
ClonExpress II One Step Cloning Kit	Vazyme	C112
DH5α Competent Cells	Sangon Biotech	B528413
Direct-zol RNA Miniprep	ZYMO RESEARCH	R2050
DMEM Medium	BasalMedia	L110KJ
EasySep Mouse CD4+ T Cell Isolation Kit	STEMCELL	19852
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 660	Invitrogen	65-0864-18
EndoFree Mini Plasmid Kit II	TIANGEN	DP118-02
ExFect Transfection Reagent	Vazyme	T101-01
Fetal Bovine Serum, Premium Plus	Gibco	A5669701
FITC anti-mouse IL-17A Antibody (TC11-18H10.1)	BioLegend	506907
Formaldehyde solution	Macklin	F864792
HiScript IV RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）	Vazyme	R423-01
Ionomycin	Beyotime	S1672
Mitomycin C	Maokang Biotechnology	7/7/1950
Mouse GRCm38	NCBI	RefSeq v.108.20200622
OPTI-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985070	reduced serum medium
Pacific Blue anti-mouse CD4 Antibody (RM4-5)	BioLegend	100531
PE/Cyanine7 anti-mouse CD25 Antibody (PC61)	BioLegend	102015
PE/Cyanine7 anti-mouse CD4 Antibody (GK1.5)	BioLegend	100422
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
PMA/TPA	Beyotime	S1819
R26-CAG-Cas9 mice	Shanghai Model Organisms Center	Cat. NO. NM-KI-00120
Recombinant Human TGF-beta 1 (CHO-Expressed) Protein, CF	R&D Systems	11409-BH
Recombinant Murine IL-6	PeproTech	216-16
Research Cell Analyzer	BD Biosciences	BD LSRFortessa
Research Cell Sorter	SONY	MA900
RPMI 1640 Medium	BasalMedia	L210KJ
SimpliAmp Thermal Cycler PCR System	Applied Biosystems	A24811
Sodium pyruvate solution (100 mM)	Sigma-Aldrich	S8636
Ultra-LEAF Purified anti-mouse CD28 Antibody (37.51)	BioLegend	102121
Ultra-LEAF Purified anti-mouse IFN-γ Antibody (XMG1.2)	BioLegend	505847
Ultra-LEAF Purified anti-mouse IL-4 Antibody (11B11)	BioLegend	504135
Ultra-LEAF Purified anti-mouse IL-12/IL-23 p40 Antibody (C17.8)	BioLegend	505309
β-Mercaptoethanol (50 mM)	Solarbio	M8211