使用质谱法对人脑类器官进行分子成像

摘要

开发了一种先进的脑类器官质谱成像 （MSI） 方法，该方法允许在这些模型中绘制代谢物分布图。这项技术提供了对早期发育和疾病期间大脑代谢途径和代谢物特征的见解，有望更深入地了解人脑功能。

摘要

脑类器官模型是研究人脑发育和功能的有力工具。质谱成像 （MSI） 是一项尖端技术，使我们能够绘制这些类器官中不同分子（如脂质、糖、氨基酸、药物及其代谢物）的空间分布，所有这些都不需要特定的分子探针。高质量的 MSI 数据取决于细致的样品制备。固定剂起着关键作用，但戊二醛、多聚甲醛和蔗糖等冷冻保存剂可能会无意中影响组织代谢物。最佳固定需要在液氮中快速冷冻。然而，对于小型类器官，更合适的方法是将类器官直接从培养箱转移到加热的包埋溶液中，然后在干冰冷却的乙醇中冷冻。另一个关键步骤是冷冻切片前的包埋，这也需要与 MSI 兼容的材料，因为传统选项会干扰基质沉积和电离。在这里，提出了一种针对人脑类器官高分辨率 MALDI-MSI 的优化方案，包括使用质谱法进行样品制备、切片和成像。该方法展示了小代谢物（如氨基酸）的分子分布，具有较高的质量精度和灵敏度。因此，再加上脑类器官的补充研究，它可以帮助阐明控制早期大脑发育、代谢细胞命运轨迹和独特代谢物特征的复杂过程。此外，它还提供了对类器官内分子精确位置的见解，丰富了我们对 3D 脑类器官模型空间组织的理解。随着该领域的不断发展，预计会有越来越多的研究利用 MSI 深入研究大脑类器官和复杂的生物系统，从而加深对人脑功能和发育的代谢方面的理解。

引言

源自原代组织干细胞、胚胎干细胞或诱导多能干细胞 （iPSC） 的类器官模型^1,2,3 通过提供与器官特异性功能紧密结合的三维模型，有助于研究人类发育、疾病机制和药物发现，从而推动了人类生物学研究 ^4,5.在这种情况下，解开大脑类器官的复杂性对于理解大脑的生理和病理发育至关重要 ^6,7，需要质谱成像 （MSI） 等技术 ^8,9。与传统质谱法不同，MSI 能够在单个组织切片内对数百到数千个生物分子进行直接、无标记的映射，从而提供对分子样脂质、肽、氨基酸、药物及其代谢物的空间分布的详细见解，而无需特定的分子探针^10,11.此外，MSI 分子图像可以共同配准到组织学和免疫染色切片上，从而提供组织形态、细胞特异性和分子含量的全面视图。

MSI 为类器官研究带来了重大前景，提供了对疾病的分子基础、遗传-表型关系和对环境刺激的反应的见解 12,13,14,15。在制药行业，MSI 促进了临床前模型中药物吸收、分布、代谢和消除的分析^11,16。此外，它有助于解决其生物转化的代谢物，这些代谢物可能具有药理活性¹⁷。

在 MSI 方法中，基质辅助激光解吸/电离 （MALDI）、解吸电喷雾电离 （DESI） 和二次离子质谱 （SIMS） 占主导地位 9,18,19,20,21。其中，MALDI-MSI 因其多功能性、宽质量范围、直接分析能力以及与各种组织特异性化合物的兼容性而脱颖而出²²。然而，尽管 MALDI-MSI 具有潜力，但它在脑类器官研究中的应用仍未得到充分探索。为了解决这一差距，引入了一种针对脑类器官高分辨率 MALDI-MSI （HR-MALDI-MSI） 分析的定制方案，以优化组织保存、基质选择和成像条件，确保可靠地获取高质量数据¹⁵。该详细的协议展示了 HR-MALDI-MSI 的能力，为研究人员提供了额外的武器库，以利用这项技术的力量以前所未有的细节探索类器官的代谢景观。

研究方案

协议的一般溢出如图 1 所示。材料 表中列出了研究中使用的试剂和设备的详细信息。

1. 脑类器官切片制备

1. 根据先前发表的报道^23,24 从诱导多能干细胞 （iPSC） 中制备脑类器官（培养达到 30-60 天时大小为 2-3 mm），并使用大口径尖端在所需时间收集它们。
   1. 在室温下用不含CaCl₂ 和MgCl₂ 的1x Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）洗涤制备的类器官三次以冲洗培养基，然后在室温下用蒸馏水非常快速地冲洗DPBS中的任何盐。
2. 通过在 70-80 °C 下搅拌和加热明胶（10 mg 在 100 mL DPBS 中）2 小时，从冷鱼皮中制备 10% 的明胶溶液，然后将溶液移至 37 °C 培养箱中 30 分钟以去除气泡并平衡至培养箱的温度类器官生长。
   注意：建议为每个实验准备新鲜的明胶，但如果需要，可以使用长达 1 周（在 4 °C 下储存）。明胶在室温下会凝固，需要先加热后再用作包埋液才能变成液体。
3. 用小移液器吸头将类器官固定在塑料模具的中心 （25 mm x 20 mm x 5 mm），然后轻轻地将 10% 明胶包埋溶液倒入模具中，直到类器官完全浸入（模具应大约半填充）。
   1. 将模具放入含有冷 100% 乙醇的干冰上的培养皿中，使其快速冷冻（1-2 分钟）。完全冷冻后，颜色变为纯白色证明，从培养皿中取出类器官-明胶块，用铝箔包裹或放入锡杯中，密封以防止水浓缩，并在 -80°C 下储存，直到准备冷冻切片。
4. 对于冷冻切片，将含有类器官的塑料块置于 -20 °C 至 -25 °C 的冷冻室中 10-15 分钟，以与室温度平衡。使用低温切片机将类器官分成 14 μm 切片，并在氧化铟锡涂层的载玻片（ITO 载玻片）上解冻安装以进行 MSI。
5. 立即在质谱仪中扫描结构均匀的切片，或将其密封在容器中并储存在 -80°C 以备后用。

2. MALDI-MSI 的基质制备和应用

1. 对于 MALDI-MSI，喷涂载玻片并用基质包被组织切片，基质是一种有助于电离不同代谢物的有机化合物²⁵。不同的基质用于对不同种类的分子进行成像;因此，首先，必须选择最适合研究的矩阵。
   注意：本研究侧重于与线粒体代谢途径相关的小代谢物和氨基酸的定位和分布，并相应地选择基质（有关脂质的映射，请参见 Cappuccio 等人。¹⁵.
2. 首先，从 -80 °C 中取出 ITO 载玻片后，立即将载玻片放入干燥器中 20 分钟，以尽量减少大气水在表面上的冷凝。
3. 制备 N-（1-萘基）乙二胺二盐酸盐 （NEDC），它是适用于小代谢物的基质，因为它在 500 Da²⁶ 的 m/z 下提供目标分析物的强烈信号，而不会干扰背景信号。使用加热的气动喷雾器在载玻片干燥后，将 10 mg/mL 70% 甲醇中的 NEDC 溶液喷洒到类器官切片上。
4. 按如下方式设置矩阵喷涂机参数：喷嘴温度 = 75 °C，喷嘴速度 = 1,250 mm/min，泵流速 = 100 μL/min，通过次数 = 8，轨道间距 = 2.5 mm，气体流速 3 L/min，干燥时间 = 10 秒和 10 psi 氮气压力。

3. MALDI-MSI 仪器

1. 为了实现用于可视化脑类器官代谢物的高分辨率 MALDI-MSI 平台，请将具有双离子漏斗接口的 MALDI 离子源安装到质谱仪上。
2. 使用连接的 Q 开关、频率三倍 Nd 激光器，波长为 349 nm，重复频率为 1 kHz，脉冲能量约为 1.3-1.4 μJ。
3. 为避免过采样，请将激光器聚焦到直径为 ~15 μm 的光斑尺寸。
4. 将样品连接到 MALDI 注射器阶段。作和维护 7.4-7.5 Torr 的高压离子漏斗，并将低压离子漏斗保持在 1.6-1.8 Torr。
5. 将 604 kHz、80 V0 峰值和 780 kHz、191 V0 峰值的射频电压分别施加到高压和低压离子漏斗。
6. 为了提高对低质量范围内小代谢物的灵敏度，将 MALDI-MSI 源的低压和高压漏斗中的 RF 振幅分别降低到约 20% 和 15%。
7. 将质量分辨率设置为 70,000。选择要在 MALDI 注射器软件中测量的区域和像素大小（25 μm/像素）。

4. MALDI-MSI 数据采集和数据分析

1. 在负离子和正离子模式下采集 m/z 范围为 80-900 的数据。以每像素 25 μm 的横向分辨率扫描样品，以获得 14 μm 类器官切片。
2. 将质谱仪上的离子进样时间设置为 250 ms，并在自动增益控制 （AGC） 关闭时在配置文件模式下采集傅里叶变换质谱 （FTMS）²⁶。
3. 使用 NEDC 矩阵峰作为内部在线质量校准，质量精度优于 ±5 ppm。
4. 使用兼容的软件处理数据。将 MSI 谱图数据直接导入软件，然后使用卷积算法执行基线校正，并使用总离子计数 （TIC） 对数据进行归一化。
5. 使用 Δm/z = 0.01 或 ±5 ppm 的分箱宽度从原始数据文件中生成离子图像的特征列表，以根据质量缺陷和像素覆盖率区分 m/z 图像。
6. 从单个代谢物离子种类生成伪彩色 （Jet） 或 RGB （红-绿和蓝） 图像。将从 MALDI-MSI 获得的原始数据文件的 m/z 列表上传到人类代谢组数据库 （HMDB）（质量容差<相对于理论 m/z 为 5 ppm）以鉴定代谢物。
   注：从 LC-MS/MS 数据获得的代谢物的精确质量和预测公式和结构也用于查询代谢组学数据库（例如，HMDB、Metlin）以进行代谢物比较和鉴定。

结果

这是使用 MSI 优化分子（代谢）成像的方案（图 1，另请参阅 Cappuccio 等人。¹⁵. 最可靠的数据和组织形态保存是使用来自冷鱼皮的 10% 明胶实现的，这通过连续切片的组织学染色得到证实。使用 60 天人脑类器官的鱼明胶包埋，使用 MSI 绘制克雷布斯循环相关代谢物，证明它们的空间分布（图 2）。

总体而言，优化的方案始终如一地提供可靠的结果，其中 10% 的冷鱼皮明胶作为首选包埋材料，并微调了 NEDC 基质喷雾设置以提高图像分辨率。在脑类器官中检测到的小代谢物为了解该组织的分子复杂性提供了有价值的见解。

图 1：人脑类器官代谢组研究的一般管道。通过诱导多能干细胞从个体成纤维细胞衍生的类器官用于 LC-MS 和 MSI，以突出代谢物的空间分布。请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：绘制 Krebs 循环相关代谢物。 使用 MSI 使用来自健康对照的 60 天类器官鉴定和分布 Krebs 周期相关代谢物。显示苏木精和伊红染色。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

针对人脑类器官高分辨率 MALDI-MSI 的改进方案精心解决了确保结果可靠性的关键步骤。样品保存至关重要，为了避免组织开裂和损伤，提出了一种替代冷冻方法，包括加热的包埋溶液和干冰冷却乙醇。该方案最适合微小大小的组织，例如人脑类器官¹⁵。最佳切割温度 （OCT） 化合物和福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 等包埋材料会干扰基质沉积和电离，因此应谨慎使用。相反，来自冷鱼皮的 10% 明胶被强调为最佳包埋解决方案，展示了其在冷冻切片过程中保持组织完整性的功效¹⁵。此外，基质及其沉积技术（如干喷涂）的选择对于最大限度地减少低 m/z 小代谢物的离域并提高图像分辨率至关重要。

成功检测和可视化人脑类器官中的广谱分子¹⁵ 证实了该方案的稳健性和可靠性，从而对其空间分布和潜在的生物学意义产生了宝贵的见解。这些发现显着增强了对大脑类器官内复杂分子景观的理解，阐明了支撑大脑发育和功能的关键信号通路和代谢过程。

虽然目前的数据为不同物种的定位提供了新的见解，但本研究中使用的 Spectroglyph MALDI 成像源尚未达到单细胞水平的分辨率（目前为 ~10-20 μm）。其他平台，如布鲁克的 timsTOF 和 Water 的 MRT，可以提供 5 μm 的单细胞分辨率，因此，重要的是要记住用于实验的仪器。

尽管存在这些限制，但脑类器官的高分辨率 HR-MALDI-MSI 仍具有相当大的前景。绘制类器官内代谢物和脂质分布的能力为代谢细胞命运轨迹、通路和独特特征提供了独特的点，这对类器官的发育和成熟至关重要。这种方法是传统组织学和分子分析之间的桥梁，有助于更深入地理解基因组、表型组和环境反应之间的相互联系。

总之，人脑类器官的 HR-MALDI-MSI 优化方案构成了研究人员探索类器官模型的宝贵资产。这种方法通过仔细解决关键步骤、故障排除和承认局限性，为进一步阐明支撑大脑发育和功能的分子复杂性奠定了基础。随着 MSI 技术的发展和越来越容易获得，它有望促进我们对早期人类发育、疾病建模和药物发现的理解。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1S, 2S)-1,2-di-1-Naphthyl-ethylenediamine dihydrochloride	Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)	1052707-27-3	Matrix substance for MALDI-MS, ≥99.0% (HPLC)
1× Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)	Life Technologies, USA	14190-144	Without CaCl2 and MgCl2
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA	2069G	Reduce potential contamination
Cryomolds	Tissue-Tek	25608-916	Standard mold with flat-surface
Entellan	Fisher Scientific	M1079610500	Cover slips
Eosin Y	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	E511-25	Certified Biological Stain
Fish gelatin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)	G7041	Powder form from cold water fish skin
Hematoxylin	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	517-28-2	Certified biological stain Elevated pressure imaging source with
HTX M5+ sprayer	HTX Technologies LLC, Carrboro, USA		Matrix sprayer
Indium tin	Hudson Surface Technology,	PL-IF-000010-P25	Provide a conductive surface for MALDI imaging
MALDI ion source	Spectroglyph LLC, USA		dual ion funnel interface
Methanol	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	67-56-1	HPLC grade
oxide (ITO) conductive–coated slides	New York, United States
Porcine gelatin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)	G1890	Powder form from porcine skin
Q-Exactive mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA		High resolution mass spectrometry
SCiLS Lab software	version 2024a Pro		for processing the data
Water	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	W6500	HPLC grade
	(Waltham, MA, USA)