小鼠眼模型中视网膜缺血再灌注损伤的诱导

摘要

该方案通过前房插管和眼压升高诱导视网膜缺血，然后眼压正常化以启动再灌注，从而模拟小鼠眼中的视网膜缺血再灌注损伤。

摘要

已知缺血再灌注损伤会导致一系列视网膜病变，包括糖尿病性视网膜病变、青光眼、视网膜血管阻塞和其他血管阻塞性疾病。本手稿提出了一种在小鼠模型中诱导缺血再灌注损伤的方法。该方法利用连接到盐水储液器的前房插管，产生静水压力，将眼压提高到 90-100 mmHg。这种方法有效地导致视网膜毛细血管收缩，诱发视网膜缺血。在缺血期结束时 （60 min），眼压恢复正常 （≤20 mmHg），然后从前房取出套管开始再灌注。缺血/再灌注手术后几天，收集眼睛并切块进行组织学染色。通过评估视网膜损伤的 8 个参数对视网膜切片的组织病理学进行评分： 皱褶、出血、变形、神经节细胞、内核、外核和感光层细胞丢失，以及视网膜色素上皮细胞损伤。该方法为研究视网膜缺血/再灌注损伤的机制和病理学提供了一个可重复的模型。此外，该模型可以促进发现治疗视网膜缺血/再灌注损伤的潜在治疗靶点，推进视网膜病理学的研究并改善患者预后。

引言

缺血/再灌注损伤表现为各种视网膜病变，包括糖尿病视网膜病变、青光眼、视网膜血管阻塞和相关的血管闭塞疾病。鉴于视网膜的高需氧量，它特别容易受到缺血/再灌注损伤的影响，这种现象与糖尿病视网膜病变等疾病的发病机制有关。这种形式的损伤会导致视网膜神经节细胞 （RGC） 死亡、视网膜形态变性、视网膜功能受损，并最终导致视力障碍¹。缺血/再灌注建模适用于研究与缺血/再灌注损伤相关的各种视网膜病变的机制和治疗反应。

我们专注于改进小鼠眼缺血/再灌注损伤的模型。压力性视网膜缺血损伤的前房插管模型由 Büchi 等人于 1991 年首次发表²。他们成功地在受控时间内将眼压提高到 110 mmHg。他们发现，由此产生的视网膜损伤与类似于视网膜和脉络膜血管阻塞的发现一致。由于其相对简单的方法和具有成本效益的执行，它成为研究视网膜缺血性损伤的功能模型。我们增加了一个额外的步骤，即在拔出针头之前将输液源降低到小鼠的水平。这防止了在拔针时在眼内形成可能的高压差，从而导致与缺血/再灌注无关的眼内损伤。

目的是创建一个受控且可复制的模型，用于研究小鼠模型中视网膜缺血/再灌注损伤的机制和病理学，同时最大限度地减少对眼睛的手术损伤。该模型提供了一种确定潜在治疗方法并增强我们对与血管阻塞相关的视网膜病理学的理解的方法。

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研究方案

所有程序均根据波士顿大学机构动物护理和使用委员会根据 NIH 实验动物护理和使用指南批准的动物使用方案进行，并符合视觉和眼科学研究协会 （ARVO） 关于动物在眼科和视觉研究中使用的声明。

1. 实验动物

1. 在标准条件下饲养 C57BL/6J 小鼠。

2. 准备所需的溶液和输液管路

1. 在 50 mL 注射器中，每只小鼠填充 1 份无菌的 0.9% NaCl 盐水溶液。将注射器放置在工作台表面水平上方 120 cm 的高度。
2. 将装满的注射器连接到输液管路和旋塞阀，旋塞阀的末端连接有 30 G 针头。冲洗掉管路上的所有气泡。

3. 准备工作区

1. 在盐水瓶下设置手术/解剖显微镜。
2. 通过在海绵中切出大约 6 厘米 x 3 厘米的凹陷并将其牢固地放置在聚苯乙烯泡沫塑料井或其他扁平容器中，创建一张床以在手术过程中稳定鼠标。

4. 麻醉鼠标

1. 用氯胺酮和甲苯噻嗪的标准混合物麻醉小鼠，以实现深度麻醉。
   注意：在该方案中，腹膜内注射氯胺酮 100 mg/kg 和甲苯噻嗪 10 mg/kg 的混合物以达到足够的麻醉深度。
2. 当脚趾捏伤没有爪子退出，并且轻轻触摸角膜时没有眨眼反射时，实现充分的麻醉。如果小鼠在麻醉时出现任何疼痛迹象，例如换气过度或肢体运动，请进行额外的麻醉。

5. 扩张虹膜

1. 扩张眼睛的虹膜，用 1 滴 1% 热带胺灌注。让 5 分钟进行扩张。将滴眼药膏（如杆菌肽）涂抹在不灌注的眼睛上。

6. 前房插管

1. 将麻醉的鼠标牢固地放在显微镜下的海绵床上。将生理盐水涂抹在眼睛上，以冲洗眼睛表面的任何碎屑或毛皮。
2. 使用一对无齿镊子，轻轻地提出其中一只眼睛。
   注意：实验将使用鼠标的左眼或右眼，但绝不会在同一只鼠标上使用。
3. 在输液管闭合的情况下，用针头在距离角膜缘约 2 毫米处插管前房。确保针头垂直于外周弯曲的角膜表面刺穿角膜，然后平行于虹膜平面略微变平。可以纵角膜以推进针头并保持眼控。避免撞击虹膜或晶状体并扩大角膜伤口，这可能会导致渗漏。Buchi 等人进一步描述了细节²。

7. 缺血期

1. 转动旋塞阀以运行输液管路。确认角膜伤口没有渗漏。确保随着眼压的增加，角膜逐渐膨胀。
   注意：如果角膜膨胀时明显渗漏没有密封，则无法保持足够的压力，并且必须在不同的鼠标上进行手术。
2. 用眼压计检查眼压是否已升高至 90-100 mmHg。用胶带固定输液管，小心确保针头不会改变位置并开始渗漏。
3. 将杆菌肽等眼药膏涂抹在灌注的眼睛上，以防止干燥。将鼠标远离显微镜并放在加热灯下方，以保持正常体温并在接下来的 60 分钟内监测。
4. 在手术结束前 30 分钟重新测量眼压，以确保眼压在 90-100 mmHg 之间。

8. 再灌注期

1. 60 分钟后，将鼠标放回显微镜中。将盐水溶液瓶降低到小鼠的水平，使眼压正常化。
2. 用眼压计测量眼压，检查是否接近正常值，即 20 mmHg。眼压恢复正常后，小心地取出针头，以免损坏晶状体或虹膜。

9. 术后护理

1. 用任何眼科抗菌软膏（如杆菌肽兽用眼药膏）涂覆小鼠眼睛。
2. 在加热的表面上监测小鼠 1-2 小时，直到它们从麻醉中完全恢复。在鼠标恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前，不要让鼠标无人看管。完全恢复后，将小鼠放回笼子和住房。

10. 遮蔽眼睛³

1. 首先用腹膜内注射氯胺酮 100 mg/kg 和甲苯噻嗪 10 mg/kg 的混合物麻醉小鼠，然后通过颈椎脱位安乐死。
2. 将安乐死的鼠标放在平坦、干燥和光滑的表面上。用几滴生理盐水冲洗眼睛。
3. 用镊子轻轻按压外眦，直到眼球从眼窝移位并且可以看到视神经。使用 Westcott 剪刀，沿着眼眶边缘剪断以切断眼外肌。
4. 将 Westcott 剪刀放在眼窝的最后部并切断视神经。

11. 固定样品⁴

1. 将去核的眼睛放入密封小瓶中的 0.1 M PBS 中的 4% 多聚甲醛中。3 天后，取出眼睛，将其放入 70% 乙醇溶液的小瓶中，并储存过夜。
2. 取出眼睛并将它们放入 95% 乙醇溶液的小瓶中。然后，将样品瓶置于密封真空中 15 分钟，将其从真空中取出，并在室内空气中放置 45 分钟。
3. 重复真空过程，依次将眼睛放入以下溶液中：100% 乙醇、100% 乙醇、100% 二甲苯溶液和 100% 二甲苯溶液。
4. 取出眼睛并将其放入干净的空样品瓶中。用 60 °C 液态石蜡填充小瓶。将样品瓶放入密封的 60 °C 真空烘箱中 30 分钟，然后在 60 °C 无真空的烘箱中放置 30 分钟。
5. 取出眼睛，将其放入干净的空小瓶中，并用 60 °C 液态石蜡填充。将样品瓶在 60 °C 下储存过夜。

12. 包埋样品

1. 将眼睛转移到金属包埋模具中，并在 60 °C 的热板上用液态石蜡填充模具，将眼睛定向到所需的方向以穿过视盘进行切片。让模具在室温 （RT） 下冷却，然后在 4 °C 下储存。

13. 样品切片⁵

1. 将包埋的标本转移到切片机上。慢慢修剪块，直到到达眼睛并且切片包括视盘。
2. 将切片切割成 5 μm 厚的带状，并将它们漂浮在水浴上。用镊子小心提起石蜡带，将三段带放在载玻片上，然后晾干一夜。
3. 重复此过程，直到每只眼睛至少有 8 张载玻片，其部分位于视盘中心。

14. 切片染色⁵

1. 将载玻片在 60 °C 烘箱中加热 1 小时以熔化石蜡。将载玻片浸入 RT 二甲苯中 3 次，每次 5 分钟。
2. 将载玻片浸入 100% 乙醇中 3 次，每次 3 分钟。用自来水冲洗切片 1 分钟。
3. 将切片在苏木精染色中孵育 45 秒。用自来水冲洗切片 2 分钟。
4. 将切片在 Bluing 试剂中孵育 1 分钟。用自来水冲洗切片 1 分钟。
5. 将切片在曙红中孵育 15 秒。
6. 用 95% 和 100% 乙醇冲洗切片两次，每次 1 分钟。用 100% 二甲苯冲洗切片 4 次，每次 1 分钟。然后，使用封固剂安装玻片。

15. 组织学分析⁶

1. 在显微镜下分析每个视网膜切片并记录视网膜褶皱的数量、视网膜各层（神经节细胞层、内核层、外核层）中细胞丢失的百分比、玻璃体或视网膜下出血的存在以及视网膜色素上皮损伤的程度。有关评分标准的详细信息，请参阅 表 1 。

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结果

为了评估缺血/再灌注后视网膜的病理学，在手术后 2 天从一组小鼠和手术后 7 天从另一组小鼠中收集眼睛。将去核的眼睛固定在 4% 多聚甲醛中，包埋在石蜡中，并切成 5 μm 的切片。用苏木精和伊红 （H&E） 对切片进行染色，并成像以进行组织学检查（图 1）。染色的组织学图像显示，与第 2 天眼睛的视网膜相比，I/R 后 7 天视网膜细胞的损伤和丢失?...

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讨论

缺血/再灌注模型为研究视网膜缺血/再灌注损伤的机制和病理提供了一种可重复的方法。该模型可用于研究视网膜缺血/再灌注损伤的病理学以及确定治疗靶点。实验方案中的几个关键步骤可能会带来挑战，并且需要技术技能才能成功完成。一种是实际的插管，可能需要多次尝试才能掌握，并且有损坏眼睛其他结构的风险。此外，角膜伤口渗漏可能有多种原因，包括插管不...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Proparacaine	Sandoz	61314-016-01
1% tropicamide	Sumerset Therapeutics	700069-016-01
30 G needle	Becton Dickinson	305106
4% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15700
Bluing reagent	Fisher Scientific	22-050-114
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	664
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Eosin stain	Electron Microscopy Sciences	26051-11
Hematoxylin stain	Electron Microscopy Sciences (Gill's #2)	26030-20
Imager	Olympus	Q-Color 5
Infusion line (included in the in vivo perfusion system)	Braintree Scientific	IV4140
Ketamine	Covetrus	10004027	Zoetis NDC# 00856440301
Microscope	Olympus	CX-33
Microtome	Microm	HM335S
Ophthalmic antibacterial ointment	Henry Schein	1410468	Baush & Lomb NDC# 2420879535
Permount Mounting Media	Fisher Scientific	SP15-100
Prism	GraphPad	10.3.1 for macOS	data collection, statistical anlaysis, graphs
Saline Solution	KD Medical Inc	50-103-1363
Stopcock (included in the in vivo perfusion system)	Braintree Scientific	IV4140
Tonometer	iCare	TA01i
Xylazine	Covetrus	1XYL006	Covetrus NDC# 11695402401