研究维生素 A 膜受体和视蛋白与其配体在产生视黄基蛋白中的相互作用的方法

Summary

在这里，我们描述了两种定量方法，用于研究维生素 A 膜受体和光感受器视蛋白与其各自生理配体的蛋白质-配体相互作用。

Abstract

膳食维生素 A/全反 式视黄醇 （ROL） 在体内的分布对于维持外周组织中的类视黄醇功能和产生视黄二烯蛋白以实现视觉功能至关重要。RBP4-ROL 是 ROL 与存在于血液中的视黄醇结合蛋白 4 （RBP4） 的复合物。两种膜受体，肝脏中的视黄醇结合蛋白 4 受体 2 （RBPR2） 和眼睛中的视黄酸 6 视黄醇 （STRA6） 模拟，结合循环 RBP4，这种机制对于将 ROL 内化到细胞中至关重要。建立研究受体-配体动力学的方法对于了解维生素 A 受体对类维生素 A 稳态的生理功能至关重要。使用表面等离子体共振 （SPR） 测定，我们可以分析维生素 A 膜受体与其生理配体 RBP4 的结合亲和力和动力学参数。

这些方法可以揭示 RBPR2 和 STRA6 中 RBP4 结合基序的新结构和生化信息，这对于理解维生素 A 缺乏症的病理状态至关重要。在眼睛中，内化的 ROL 被代谢为 11-顺式视黄醛，这是一种视觉发色团，与光感受器中的视蛋白结合形成视黄二烯蛋白，视紫红质。光的吸收导致 11-顺式视黄醛的顺反异构化，诱导视紫红质的构象变化和随后的光转导级联反应的激活。血清和眼部 ROL 浓度降低会影响视黄二烯蛋白的形成，进而导致视紫红质错位、载脂蛋白视蛋白积累、夜盲症和感光器外段变性，导致视网膜色素变性或 Leber 先天性黑朦。

因此，定量视网膜中 G 蛋白偶联受体视蛋白-11-顺式 视网膜复合物的分光光度法对于理解上述病理状态下视网膜细胞变性的机制至关重要。通过这些全面的方法，研究人员将能够更好地评估膳食维生素 A 供应在维持全身和眼部类视黄醇稳态方面的作用，这对于在光感受器中产生和维持视黄二烯蛋白浓度至关重要，这对于维持人类的视觉功能至关重要。

Introduction

饮食获得的维生素 A/全反式视黄醇/ROL 是在视觉功能中发挥作用的重要成分 ^1,2。发色团 11-顺式视黄醛是膳食维生素 A 的一种代谢产物，与 G 蛋白偶联受体 （GPCR） 视蛋白结合，在光感受器中产生视黄二烯蛋白，视紫红质。当光线落在眼睛上时，视紫红质的构型通过其 11-顺式-视黄醛成分转化为全反式视黄醛发生根本性变化。这种构型变化触发杆状光感受器内的光转导级联反应，将光转化为电信号，通过视神经传输到大脑的视觉皮层 3,4,5,6,7,8,9,10 .血清和眼部 ROL 浓度降低会影响视黄二烯蛋白的形成，进而导致视蛋白错位、载脂蛋白视蛋白积累....

Protocol

1. 表面等离子体共振 （SPR） 方法

1. 小鼠 RBP4 蛋白的制备和纯化
   1. 设计引物以生成全长小鼠 RBP4 （msRBP4） cDNA（NCBI 参考序列：NM_001159487.1）。将 msRBP4 cDNA 克隆到 pET28a His 标签卡那霉素抗性表达载体中，并在 BL-21 DE3 细胞中表达（材料表）。
   2. 用连接的 msRBP4-pET28a 载体转化 BL-21 DE3 感受态细胞（根据制造商的方案），然后接种到含有卡那霉素 50 μg/mL^30,37 的 Luria-Bertani （LB） 肉汤琼脂平板上。将板在37°C下在培养箱中孵育过夜，并在第二天筛选阳性菌落。
   3. 挑选单个菌落，并在 37 °C 下在 5 mL 含有卡那霉素 50 μg/mL 的 LB 肉汤中孵育过夜。
   4. 对于在 500 mL 含有卡那霉素 50 μg/mL 的 LB 肉汤中进行二次培养，使用 1% 体积的原代培养物（来自步骤 1.1.3）并在 37 °C 下孵育 3-4 小时;使用分光光度计检查光密度。理想情况下，如果 OD 值在 0.6....

Discussion

协议中的关键步骤
战略风险投资方法
计算机建模和对接分析：RBPR2 （https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1） 和 STRA6 的预测结构，以及 msRBP4 PDB 数据库 （RSCB PDB ID： 2wqa） 的已知结构，应用于对接研究^29,31。此外，应使用体外方法（细胞培养）来确认维生素 A 受体（RBPR2 和 STRA6）上?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-D Quant Kit	Cytiva	80648356
Amine Coupling Kit	Cytiva	BR100050
Biacore evaluation software	Biacore S200	Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5	Cytiva	BR100530
Bis tris propane	Sigma	B6755-25G	20 mM
BL21 DE3 competent cells	Thermo Scientific	EC0114
CD spectrophotometer	Jasco	J-815 Spectropolarimeter
Glycine HCL	Fisher Bioreagents	BP381-1
GraphPad Prism			Model fitting, data analysis
LB broth	Fisher Bioreagents	BP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM)	EMD Millipore	324355-1GM	2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector	Addgene	69864-3
Plasmid purification kit	Qiagen	27106
Rho1D4 MagBeads	CubeBiotech	33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysis cassette	Thermo Scientific	66810
Tween20	Fisher Bioreagents	BP337-500	0.05%
UV vis Spectrophotometer	Agilent	Cary 60 UV-Vis
Peptide name	Peptide sequence	HPLC-purity	Mass Spec
Mouse Rbpr2 (42)	HVRDKLDMFEDKLESYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	92.14%	Conforms
Mouse Stra6 (40)	SVVPTVQKVRAGINTDVSYL LAGFGIVLSEDRQEVVELVK	90.84%	Conforms
Mouse Rbpr2 mutant S294A (42)	HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	0.92%	Conforms