研究维生素 A 膜受体和视蛋白与其配体在产生视黄基蛋白中的相互作用的方法

摘要

在这里，我们描述了两种定量方法，用于研究维生素 A 膜受体和光感受器视蛋白与其各自生理配体的蛋白质-配体相互作用。

摘要

膳食维生素 A/全反 式视黄醇 （ROL） 在体内的分布对于维持外周组织中的类视黄醇功能和产生视黄二烯蛋白以实现视觉功能至关重要。RBP4-ROL 是 ROL 与存在于血液中的视黄醇结合蛋白 4 （RBP4） 的复合物。两种膜受体，肝脏中的视黄醇结合蛋白 4 受体 2 （RBPR2） 和眼睛中的视黄酸 6 视黄醇 （STRA6） 模拟，结合循环 RBP4，这种机制对于将 ROL 内化到细胞中至关重要。建立研究受体-配体动力学的方法对于了解维生素 A 受体对类维生素 A 稳态的生理功能至关重要。使用表面等离子体共振 （SPR） 测定，我们可以分析维生素 A 膜受体与其生理配体 RBP4 的结合亲和力和动力学参数。

这些方法可以揭示 RBPR2 和 STRA6 中 RBP4 结合基序的新结构和生化信息，这对于理解维生素 A 缺乏症的病理状态至关重要。在眼睛中，内化的 ROL 被代谢为 11-顺式视黄醛，这是一种视觉发色团，与光感受器中的视蛋白结合形成视黄二烯蛋白，视紫红质。光的吸收导致 11-顺式视黄醛的顺反异构化，诱导视紫红质的构象变化和随后的光转导级联反应的激活。血清和眼部 ROL 浓度降低会影响视黄二烯蛋白的形成，进而导致视紫红质错位、载脂蛋白视蛋白积累、夜盲症和感光器外段变性，导致视网膜色素变性或 Leber 先天性黑朦。

因此，定量视网膜中 G 蛋白偶联受体视蛋白-11-顺式 视网膜复合物的分光光度法对于理解上述病理状态下视网膜细胞变性的机制至关重要。通过这些全面的方法，研究人员将能够更好地评估膳食维生素 A 供应在维持全身和眼部类视黄醇稳态方面的作用，这对于在光感受器中产生和维持视黄二烯蛋白浓度至关重要，这对于维持人类的视觉功能至关重要。

引言

饮食获得的维生素 A/全反式视黄醇/ROL 是在视觉功能中发挥作用的重要成分 ^1,2。发色团 11-顺式视黄醛是膳食维生素 A 的一种代谢产物，与 G 蛋白偶联受体 （GPCR） 视蛋白结合，在光感受器中产生视黄二烯蛋白，视紫红质。当光线落在眼睛上时，视紫红质的构型通过其 11-顺式-视黄醛成分转化为全反式视黄醛发生根本性变化。这种构型变化触发杆状光感受器内的光转导级联反应，将光转化为电信号，通过视神经传输到大脑的视觉皮层 3,4,5,6,7,8,9,10 .血清和眼部 ROL 浓度降低会影响视黄二烯蛋白的形成，进而导致视蛋白错位、载脂蛋白视蛋白积累、夜盲症和感光细胞 OS 变性，导致视网膜色素变性或 Leber 先天性黑朦，从而导致失明 ^3,10。

全反式视黄醇是膳食维生素 A 的基本运输形式，它是所有功能性类维生素 A 和膳食维生素 A 代谢物的来源。肝脏是膳食维生素 A 储存的主要器官。肝视黄醇作为与视黄醇结合蛋白 4 （RBP4） 的复合物通过血清运输。RBP4 主要在肝脏中表达，与视黄醇底物和转甲状腺素运载蛋白 （TTR） 形成全复合物，进入循环 11,12,13,14,15,16,17。1970 年代 RBP4 细胞表面受体的报道导致了膜转运蛋白有助于类视黄醇进出细胞的假设。RBP4 结合视黄醇 （RBP4-ROL） 的细胞表面受体被眼睛视网膜色素上皮 （RPE） 中的视黄酸 6 视黄醇 （STRA6） 鉴定为模拟。STRA6 与循环全息 RBP4 复合物结合，并使 RBP4 结合的视黄醇穿梭穿过 RPE，供光感受器利用^18,19。STRA6 突变可导致与眼部 ROL 浓度降低相关的无数疾病和表型。发育过程中的 STRA6 突变可导致无眼症、小眼症和其他与马修-伍德综合征相关的表型重叠的非眼部症状 20,21,22,23,24,25,26,27。STRA6 在不同的器官和组织中表达，例如眼睛中的 RPE，但并非在所有组织中表达^26,27。虽然类维生素 A 储存的主要部位是肝脏，但 STRA6 在肝脏中不表达。

Alapatt 及其同事发现，视黄醇结合蛋白 4 受体 2 （RBPR2） 以高亲和力结合 RBP4，并负责肝脏中 RBP4 结合的视黄醇的摄取，类似于 RPE 中的 STRA6²⁸。据报道，RBPR2 与 STRA6 具有结构同源性 29,30,31。RBP4 被认为与 RBPR2 上的残基 S294、Y295 和 L296 结合，RBPR2 是 RBPR2 和 STRA6 之间部分保守的氨基酸结合结构域 29,30,31。从这些研究中，维生素 A 膜受体（如 STRA6 和 RBPR2）包含一个或多个细胞外结合残基/结构域，被认为与循环 RBP4-ROL 相互作用。因此，膜受体在受体与循环 RBP4 的结合中起重要作用，以便 ROL 内化到靶组织（如肝脏和眼睛）中。

在本研究的第一部分，我们利用表面等离子体共振 （SPR） 来研究两种维生素 A 膜受体 （RBPR2 和 STRA6） 与其生理配体 RBP4 的相互作用³¹。使用 SPR 可以实时测量蛋白质与配体复合物的结合亲和力和缔合/解离动力学。该方法旨在提供有关 RBPR2 和 STRA6 中 RBP4 结合基序的关键动力学、结构和生化信息，这对于理解维生素 A 缺乏症的病理状态至关重要^31,32。如上所述，循环 ROL 通过 STRA6 内化到 RPE 中，生成发色团 11-顺式视黄醇，该发色团与视蛋白结合，在光感受器中产生视黄二烯蛋白视紫红质³³。我们使用分光光度法定量小鼠视网膜裂解物中的 GPCR-视蛋白及其配体 11-顺式视网膜复合物，这对于理解视网膜色素变性或 Leber 先天性黑朦眼部病理状态中视黄二烯蛋白、视紫红质还原的机制至关重要³⁴。一般来说，这些方案可用于体外研究突变 RBP4、STRA6 或 RBPR2 在影响全身和眼部维生素 A 稳态或突变视紫红质或类视黄醇循环蛋白对视觉功能的影响方面的生理后果^35,36。

研究方案

1. 表面等离子体共振 （SPR） 方法

1. 小鼠 RBP4 蛋白的制备和纯化
   1. 设计引物以生成全长小鼠 RBP4 （msRBP4） cDNA（NCBI 参考序列：NM_001159487.1）。将 msRBP4 cDNA 克隆到 pET28a His 标签卡那霉素抗性表达载体中，并在 BL-21 DE3 细胞中表达（材料表）。
   2. 用连接的 msRBP4-pET28a 载体转化 BL-21 DE3 感受态细胞（根据制造商的方案），然后接种到含有卡那霉素 50 μg/mL^30,37 的 Luria-Bertani （LB） 肉汤琼脂平板上。将板在37°C下在培养箱中孵育过夜，并在第二天筛选阳性菌落。
   3. 挑选单个菌落，并在 37 °C 下在 5 mL 含有卡那霉素 50 μg/mL 的 LB 肉汤中孵育过夜。
   4. 对于在 500 mL 含有卡那霉素 50 μg/mL 的 LB 肉汤中进行二次培养，使用 1% 体积的原代培养物（来自步骤 1.1.3）并在 37 °C 下孵育 3-4 小时;使用分光光度计检查光密度。理想情况下，如果 OD 值在 0.6 和 1 之间，则继续进行，以在 24 °C 下用 0.5 mM IPTG 诱导蛋白质表达过夜。
   5. 使用 0.1-1 mM 和 16-30 °C 温度范围的多种 IPTG 浓度来优化 msRBP4 表达和稳定性。
   6. 将培养物（来自步骤 1.1.5）以 16,000 × g 离心 10 分钟，弃去上清液，并将沉淀保持在冰上。
   7. 用裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.1% （v/v） Triton X-100、10% 甘油、0.5 mM PMSF 和蛋白酶抑制剂 [pH 8.0]）匀浆沉淀。使用输出功率为 250 瓦、输出频率为 40-50% 的均质器对裂解物进行 15 秒开机和 30 秒关机循环的超声处理。重复 5 次。
   8. 通过以 16,000 × g 离心 20 分钟去除细胞碎片和未裂解的细胞。将裂解物的上清液通过缓冲液平衡的镍 NTA 柱。
   9. 用含有 30 mM 咪唑的裂解缓冲液（来自步骤 1.1.8）洗涤色谱柱。
   10. 使用含有 250 mM 咪唑的缓冲液分次洗脱结合的 msRBP4 蛋白。运行洗脱的级分，并使用 12% SDS 聚丙烯酰胺凝胶目视监测蛋白质数量，用考马斯亮蓝 R-250 在甲醇：水：乙酸 （45：45：10） 溶液中染色，并用无考马斯染色的溶液甲醇：水：乙酸 （45：45：10） 进行脱色。
   11. 合并未使用的级分，并用 10 kDa MWCO 的 10K 透析盒透析合并的级分。
   12. 在 12% SDS-PAGE 凝胶上评估透析级分的质量并定量蛋白质浓度。
       注：Apo-RBP4 蛋白用于 SPR 分析。有关生成 holo-RBP4 （RBP4-视黄醇），请参阅其他地方发布的详细协议^36,37。
2. 通过色氨酸荧光测定和圆二色谱 （CD） 光谱对 RBP4 肽与 RBP4 的结构和相互作用进行初步验证
   1. 色氨酸荧光测定
      1. 使用在线蛋白质组成分析工具 （https://web.expasy.org/protparam/） 并将氨基酸序列粘贴为单字母代码，以评估重组 RBP4 蛋白以及 RBPR2 和 STRA6 的单个肽的结构组成，以确定单个肽和蛋白质中的色氨酸氨基酸残基（材料表）。
      2. 单击计算参数按钮并评估色氨酸 （Trp） 残基的氨基酸组成。
         注：色氨酸残基必须存在于被分析的单个肽或蛋白质中。
      3. 稀释各种微摩尔浓度的单个 RBPR2 和 STRA6 肽，并在室温下与 3 μg msRBP4 在 96 孔板中单独孵育 5 分钟。在 290 nm 处激发混合物，并扫描 300 nm 至 400 nm 波长的发射光。
      4. 使用空白（仅缓冲液，无肽和无蛋白质）和肽控制条件（无蛋白质）对数据进行归一化并绘图。
         注：暴露于从低到高的肽浓度时色氨酸荧光增加表明两种单独的肽与 RBP4 蛋白之间存在正相互作用。
   2. 圆二色性 （CD） 光谱
      1. 在 1x PBS 缓冲液（pH 7.0）中稀释单个肽和重组 RBP4 蛋白。使用不同浓度的 RBPR2 和 STRA6 肽以及 0.1 至 10 μg/mL 的 RBP4 蛋白进行质量检查，如下所述。
      2. 在 0.1 cm 光程比色皿中加入单个稀释的肽和蛋白质，并使用 CD 分光光度计 （195-250 nm） 测量 CD 吸光度/椭圆度。使用以下公式计算平均残差椭圆度 （θ）。
         [v] = （S × mRw）/（10cl）
         S 表示 CD 信号，单位为 mθ;mRw 表示平均残基质量;c 表示蛋白质的浓度，单位为 mg/mL;L 表示以 cm 为单位的路径长度。
      3. 使用 BeStSel 二级结构分析通过 CD 光谱 （https://bestsel.elte.hu） 进行蛋白质折叠预测来计算分子结构的百分比变化。
         注意：二级结构表示正确的折叠和守恒确认，这对交互作用研究和交互作用的结果至关重要。检查域的预测结构，并继续进行交互研究。

2. SPR 分析，以确定维生素 A 膜受体（RBPR2 和 STRA6）与其生理配体 RBP4 的结合亲和力和动力学参数

1. 为了将 RBP4 固定在 CM5 芯片表面设置上，我们使用 SPR 传感器芯片，该芯片携带一个羧甲基葡聚糖接头，延伸至 ~100 nm 的大小，共价连接在金表面上。在 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐 （EDC） 存在下， N-羟基琥珀酰亚胺 （NHS） 将芯片表面的羧基转化为 N-羟基琥珀酰亚胺酯，后者自发地与氨基酸和蛋白质的胺基反应，迫使配体共价键合到芯片表面（材料表）。
   1. 将纯化的 msRBP4 蛋白固定在传感器芯片上（图 1 和图 2）。在软件的 Run 菜单中，选择 Wizard 并继续执行固定选项。在固定缓冲液（10 mM 乙酸钠缓冲液，pH 5.0）中将配体（从步骤 1.1 获得的 msRBP4 蛋白）稀释至 10 μg/mL（4 μL 配体 + 396 μL 缓冲液），并将偶联试剂分装到小瓶中。从软件控件中打开“固定设置”向导窗口，选择“CM5 芯片”，然后选择“固定流通池 2 和目标水平 1,200 响应单位 （RU）”，以在动力学研究和洗涤溶液：乙醇胺中实现 30 RU 的 Rmax。输入名称 RBP4，然后单击 Next。
      注：可选：如果之前使用电泳缓冲液 PBST（含 0.05% Tween 20 去污剂溶液的磷酸盐缓冲盐水溶液）进行灌注，则不需要“运行前灌注”选项的“系统准备”对话框。
   2. 在 Rack position 对话框中，单击 Eject Rack。拿起架子，放置每种试剂指定体积的小瓶：156 μL msRBP4、177 μL 乙醇胺、89 μL EDC、89 μL NHS 和一个空小瓶。插入装有样品瓶的架子，然后单击 OK（确定）和 Next（下一步）。
   3. 在 Prepare Run Protocol 对话框中，单击 Start 和 Save。
2. RBPR2 和 STRA6 肽动力学测定设置
   1. 在 0.8-26.6 μM 的运行缓冲液中连续稀释小鼠 RBPR2、突变体 RBPR2 和 STRA6 肽（之前化学合成的³¹ 并列在 材料表中）。
   2. 打开控制软件并选择 Kinetics/Affinity 向导。单击 File （文件） |打开模板 并选择 Kinetics/Affinity。输入进样序列对话框 流路 2-1 （流通池 2 为 活性 流通池， 流通池 1 为 参考），选中 芯片类型 CM5，然后单击 下一步。在 设置 对话框中，选中 Run startup cycles，输入 Solution： buffer 和 cycles：，然后单击 Next。
   3. 在 进样参数 对话框中，输入 样品 参数的值： 接触时间：120 s，流速 30 μL/min，解离时间 300 s;对于 再生 参数：输入再生溶液名称：Glycine-HCl （pH 2.5）， 接触时间：30 s，流速：30 μL/min ，然后单击 下一步。
   4. 在样品对话框中，输入肽的名称、分子量和浓度，然后单击下一步。在“样品架位置”对话框中，将稀释后的肽分配为各种浓度 1 至 100 μM 的单个 ~120 μL 样品，以及 ~230 μL 缓冲液、~120 μL 缓冲液和 ~1,000 μL 甘氨酸（pH 2.5）到样品架上的位置。单击 Eject Rack（弹出架）并插入所有样品瓶。单击 Next，然后在 Prepare Run Protocol 对话框中，单击 Start，输入文件名，然后保存（图 2）。
   5. 在软件中，单击 Start 开始 菜单 并选择 Evaluation。在软件中选择 打开文件 ，然后从下拉选择菜单中选择 Fc2-1 以分析 msRBP4 和突变体 msRBPR2 和 msSTRA6 肽的缔合和解离阶段的参考细胞空白减去的活性传感图。
   6. 单击下拉 Kinetics/Affinity 按钮，然后选择 Surface bound;以打开 Select Curves 对话框，选中 Include column in the table ，然后单击 Next。选择 数据对话框 以显示空白减去的传感器图;单击 Kinetics and Affinity，保留默认参数，然后单击 Fit 选项进行曲线拟合。检查 “报告 ”选项卡，了解平衡解离常数 K_d 和 K_a 或 K_on associated rate 以及 K_d 或 K_off 解离速率。将 Kinetics 数据传感器图保存为选项卡分隔的格式.txt并使用值绘制图形（图 3）。
   7. 要确定亲和动力学常数 K_d （平衡时与一半受体结合的配体浓度），请将数据列复制并粘贴到.txt格式文件中，该文件是从软件中使用的 Evaluation to XY 图生成的。单击 Analyze and Nonlinear regression （curve fit） （分析和非线性回归 （曲线拟合）），检查 data 列，然后单击 Ok （确定）。在 参数 对话框中，单击 Binding saturation 和 One site Specific binding fitting model ，公式为：
      Y= （Bmax*X）/（Kd + X）
      其中 Bmax 是最大结合位点数（响应单位），X 是肽的浓度，Y 是结合（响应单位）（图 3）。

3. 分光光度法定量视网膜裂解物中 GPCR-11- 顺式 视网膜蛋白复合物（视黄二烯蛋白视紫红质）

1. 将由成年 WT-C57BL/6J 小鼠组成的预定小鼠组运输到暗室中。
2. 黑暗使小鼠过夜 12-16 小时，在红光下，将小鼠置于安乐死室中，并将调节器上的 CO₂ 气阀打开至 5 L/min ~5 分钟。通过对向后拉的颈部和尾部施加压力（颈椎脱位）来确保死亡。
3. 在含有 20 mM 双-三丙烷（1,3-双（三（羟甲基）甲氨基）丙烷;BTP） pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM EDTA 和蛋白酶抑制剂（材料表）。
4. 将匀浆在 4 °C 下以 16000 x g 离心 15 分钟，弃去含有水溶性胞质蛋白的上清液。在含有 20 mM 正十二烷基-β-d-麦芽糖苷 （DDM）、20 mM 双-三丙烷 （BTP） pH 7.4、100 mM NaCl、1 mM EDTA 和蛋白酶抑制剂的缓冲液中重悬和溶解沉淀的膜和膜蛋白在 4 °C 下在旋转平台上放置 1 小时。
5. 将溶解的膜级分在 16000 x g 、4 °C 下离心 1 小时。 将上清液与 30 μL Rho 1D4 抗体珠混合，并在 4 °C 下在旋转平台上孵育 1 小时。
6. 使用磁力架，使用珠子分离下拉，弃去上清液，并用缓冲液 20 mM 双三丙烷 （BTP） pH 7.4、500 mM NaCl 和 2 mM DDM 洗涤珠子。
7. 通过在室温下与含有 0.2 mg/mL 1D4 肽 （-TETSQVAPA） 的缓冲液 20 mM bis-tris 丙烷 （BTP） pH 7.4、100 mM NaCl、2 mM DDM 孵育 5-10 分钟来洗脱视紫红质蛋白（图 4 和 图 5）。
8. 使用分光光度计在快速扫描设置中，使用矩形、亚微量、石英、2 mm 孔径、10 mm 光程、50 μL 比色皿分析 200 nm 至 800 nm 洗脱液的吸光度。
   注意：仅使用高质量的石英比色皿（图 4）。
9. 为了验证和确定质量，请检查洗脱液并将其暴露在强光下 1 分钟，然后重复步骤 3.8。
10. 减去空白吸光度并计算分析的吸光度光谱与 11-顺 式视网膜结合视蛋白在 500 nm 处的吸光度、光暴露的全反 式视网膜结合视蛋白的 380 nm 和无配体 Apo-Opsin 蛋白的 280 nm 处的吸光度的比率（图 6）。不含配体视黄醇的游离视蛋白在 500 nm 处产生基线吸光度。
11. 要量化视紫红质浓度，请使用 Beer-Lambert 定律：
    A=ε·C·l 或 C=A/ε·l
    其中 A 是吸光度，ε摩尔消光系数（视紫红质 ε500 = 40,600 ^{M-1 cm-1} 游离载脂蛋白 ε280 = 81,200 ^{M-1 cm-1}），C 是浓度，l 光程。
12. 为了以百分比定量配体 - Opsin，请使用 A280/A500 的比例。
13. 绘制空白减去的吸光度光谱并计算游离视蛋白值³²。
14. 使用消光系数₅₀₀ = 40600 M ^{- 1} cm ^{- 1} 计算视紫红质的浓度ε。无配体视蛋白的浓度通过 Beer-Lambert 定律使用消光系数₂₈₀ = 81,200 ^{M-1 cm-1} ε计算。

结果

描述了定量方法，用于研究维生素 A 膜受体和光感受器视蛋白与其各自生理配体的蛋白质-配体相互作用。重组小鼠 RBP4 应在大肠杆菌中表达，纯化的蛋白质用作 SPR 芯片上的偶联配体。化学合成的 RBPR2、STRA6 和突变体 S294A RBPR2 ~40 个氨基酸肽的“SYL 基序 RBP4 相互作用细胞外位点”用作各种浓度的分析物，以测量相互作用的结合动力学和平衡饱和度 K_d（

讨论

协议中的关键步骤
战略风险投资方法
计算机建模和对接分析：RBPR2 （https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1） 和 STRA6 的预测结构，以及 msRBP4 PDB 数据库 （RSCB PDB ID： 2wqa） 的已知结构，应用于对接研究^29,31。此外，应使用体外方法（细胞培养）来确认维生素 A 受体（RBPR2 和 STRA6）上?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-D Quant Kit	Cytiva	80648356
Amine Coupling Kit	Cytiva	BR100050
Biacore evaluation software	Biacore S200	Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5	Cytiva	BR100530
Bis tris propane	Sigma	B6755-25G	20 mM
BL21 DE3 competent cells	Thermo Scientific	EC0114
CD spectrophotometer	Jasco	J-815 Spectropolarimeter
Glycine HCL	Fisher Bioreagents	BP381-1
GraphPad Prism			Model fitting, data analysis
LB broth	Fisher Bioreagents	BP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM)	EMD Millipore	324355-1GM	2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector	Addgene	69864-3
Plasmid purification kit	Qiagen	27106
Rho1D4 MagBeads	CubeBiotech	33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysis cassette	Thermo Scientific	66810
Tween20	Fisher Bioreagents	BP337-500	0.05%
UV vis Spectrophotometer	Agilent	Cary 60 UV-Vis
Peptide name	Peptide sequence	HPLC-purity	Mass Spec
Mouse Rbpr2 (42)	HVRDKLDMFEDKLESYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	92.14%	Conforms
Mouse Stra6 (40)	SVVPTVQKVRAGINTDVSYL LAGFGIVLSEDRQEVVELVK	90.84%	Conforms
Mouse Rbpr2 mutant S294A (42)	HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM NETGTLTPIILQVKELISVTKG	0.92%	Conforms