逍遥丸治疗小鼠绝经后骨质疏松症的抗炎作用研究

摘要

绝经后骨质疏松症已成为一个全球性的公共卫生问题。本研究的目的是探讨中药小药丸对这种情况的治疗效果和相关机制。

摘要

骨质疏松症是老年人和绝经后妇女常见的代谢性疾病，早期无明显症状。在这种情况的后期，患者容易发生骨折，这会严重影响他们的健康和生活质量。全球预期寿命的增加使骨质疏松症成为全球关注的问题。逍遥丹之前
用于治疗抑郁症。此外，该药物似乎具有雌激素样活性，这会影响早期成骨细胞特异性标志物 ALP 和骨细胞外基质主要成分 COL-1 的表达。评估小药丸对小鼠绝经后骨质疏松症 （PMOM） 的影响。通过中医系统药理学 （TCMSP） 数据库获取逍遥丸中各草药成分的靶点信息。利用来自 GeneCards 、 OMIM 、 PharmGkb 、 TTD 、 DrugBank 等网站的信息，通过 Cytoscape 和 String 网络构建草药复合物的调控网络，以评估蛋白质相互作用。对小鼠进行卵巢切除，并用高剂量和低剂量的逍遥丸治疗，并将其与对照组进行比较。通过骨组织的免疫细胞化学评估他们的症状。结果表明，逍遥丸具有通过 IL-17 信号通路缓解去卵巢小鼠 PMOM 症状的能力。这种药物有可能成为治疗骨质疏松症的新型治疗剂。

引言

世界卫生组织 （WHO） 将骨质疏松症 （OP） 定义为一种以骨量减少和骨组织微结构恶化为特征，导致骨脆性增加，从而增加骨折风险的疾病¹。骨质疏松症的临床意义在于它可导致骨折，这与高死亡率、发病率和经济成本有关²。绝经后骨质疏松症 （PMOP） 是由绝经后女性雌激素水平降低引起的，导致破骨细胞活性增加，导致骨质流失和骨微结构破坏。这通常会导致骨质疏松症，对健康产生严重影响³。目前的 PMOP 疗法包括雌激素替代疗法、双膦酸盐和甲状旁腺激素，但它们可能具有不同程度的不良反应、长期依从性不足和高成本⁴。因此，负担得起的草药对于很大一部分人来说是一种可行的选择。

逍遥丸被列入中国药典⁵，其中含有八种草药成分，包括柴胡、当归、白芍、白术、茯苓、薄荷草、甘草和新鲜生姜。众所周知，所有这些草药都能有效解肝健脾、养血、调节月经周期，该混合物也用于治疗抑郁症⁶。然而，逍遥丸在骨质疏松症中的作用尚不清楚。

早期研究表明，炎症会导致骨质流失⁷ ，并且更年期可能会加速与此过程相关的骨密度下降。此外，骨质疏松症的发展与炎症之间存在密切关系。炎症因子白细胞介素-17 （IL-17） 是由 CD4+ T 淋巴细胞的一个亚群 Th17 细胞分泌的促炎因子。这些细胞与多种慢性炎症有关，它们在类风湿性关节炎骨破坏的发展中起着重要作用⁸。此外，IL-17 刺激核因子-κ B 配体受体激活剂 （RANKL），RANKL 调节破骨细胞生成，导致比骨形成更大的骨吸收⁹。IL-17 刺激其他破骨细胞因子的表达，如 TNFα、IL-1、IL-6 和 IL-8。它具有与其他炎症因子协同作用的能力，使其成为重要的炎症效应物¹⁰。

研究还表明，逍遥丸与炎症之间存在联系。Shi et ^al.11 和 Fang et ^al.12 最近证实，小药丸可以分别降低 IL-6 和 TNF-α 的水平。在另一项代谢相关脂肪性肝炎的研究中，据报道，逍遥丸可以上调丙酸的表达，进而抑制 TNF-α 的表达并发挥抗炎作用¹³。然而，目前尚不清楚逍遥丸是否可以通过 IL-17 介导炎症反应来调节 PMOM 的发展，这是本研究的目的。

本研究通过网络药理学和生物信息学分析预测了逍遥丸靶点与骨质疏松症相关基因的交集，并分析了蛋白质相互作用、GO 和 KEGG 的交叉基因。基于预测结果，可以观察到 IL-17 信号通路中的关键蛋白 Act1 和 IL-6 的表达^14,15，以及骨转换标志物碱性磷酸酶 （ALP） 和 I 型胶原 （COL-1），以观察逍遥丸在 PMOM 小鼠模型中的治疗效果。

研究方案

游江民族医科大学实验动物伦理委员会批准了该研究方案（批准文号：2022101502）。雌性 C57BL/6 小鼠，10-12 周龄，SPF 级和体重 （22 ± 2） g，饲养在游江民族医科大学 SPF 级动物实验中心。实验动物维持在 24-26 °C 的温度和 55% 至 60% 的相对湿度下。

1. 中医系统药理数据库和分析平台

注：中医系统药理学数据库和分析平台 （TCMSP;https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php） 是中医药理学平台，包含有关中药成分、ADME 相关特性、靶点和疾病的信息^16,17。

1. 访问 TCMSP Web 界面。搜索 Herb 的名称，输入中药的名称，然后单击 Search。单击搜索结果中的 Latin Name 。使用参数 OB ≥ 30% 和 DL ≥ 0.18 对成分的结果进行筛选。
2. 复制所有结果并将其保存为 TXT 格式，命名为 Chinese Medicine Name_ingredients.txt。
3. 在 Related Targets 选项卡的 Targets Information 下，筛选 Mol ID（即步骤 1.2 中的结果）。
4. 复制筛选后的结果并将其保存为名为 Chinese Medicine Name_targets.txt 的 TXT 格式。
   注：通过上述步骤，获得了所有符合条件的中药 （TCM） 活性成分和相应的靶点信息。
5. 将上述所有 ingredients.txt 文件和 targets.txt 文件放在同一个文件夹中，并将 Perl 脚本（补充编码文件 1）放在该文件夹中。
6. 打开 CMD，键入 cd 文件夹路径，输入该路径，然后运行 Perl 脚本。获取新的文本文件 （allTargets.txt）。这个新的文本文件 （allTargets.txt） 包含草药名称、成分名称、成分 ID 和目标。

2. UniProt 数据库

注意：UniProt 数据库 （https://www.uniprot.org/） 包含用功能信息注释的人类蛋白质序列，用于将靶标名称标准化为其正式名称¹⁸。

1. 转到 UniProt Web 界面。单击 Search 选项卡，选择 UniProtKB，然后单击 Search。
2. 在左侧边栏中进行筛选，选择 Reviewed （Swiss-Prot） 作为 Status （Status），选择 Human （人类 ） 作为 Popular organisms。单击 “下载”，选择 “全部下载”，为 “格式” 选择 TSV ，然后单击 “下载 ” 以下载注释文件。
3. 将下载的文件解压缩到当前文件夹，打开解压缩的文件，然后将其复制并粘贴到名为 ann.txt 的文本文件中。

3. 药物靶点 ID 转换

1. 将第 1 节allTargets.txt获得的所有药物靶标文件和第 2 节ann.txt获得的 UniProt 注释文件放入一个文件夹中，并将 Perl 脚本（补充编码文件 2）放入其中。
2. 打开 CMD，键入 cd + space + folder path，输入它，然后运行 Perl 脚本以获取新的文本文件 （allTargets.symbol.txt）。这个新的文本文件 （allTargets.symbol.txt） 包含草药名称、成分 ID、成分名称和基因 ID。

4. 数据库搜索

1. GeneCards：人类基因数据库 （GeneCards） 数据库
   注：GeneCards 数据库 （https://www.genecards.org/） 提供人类基因的预测和注释信息。它用于访问疾病靶标^19,20。
   1. 转到 GeneCards Web 界面。在搜索框中键入 osteoporosis，然后单击 Search（ 搜索）。
   2. 单击 Export 并选择 Export to Excel。
   3. 打开下载的文件，复制相关性评分≥ 1 的基因，然后粘贴并保存到名为 GeneCards.txt 的文件中。
2. OMIM 数据库
   注：OMIM 数据库 （https://omim.org） 包含人类基因、遗传疾病和性状²¹.
   1. 转到 OMIM Web 界面。单击 GENE Map，在搜索框中键入 osteoporosis，然后单击 Search。
   2. 单击 Download As 并选择 Excel 文件。
   3. 打开下载的文件，复制 Approved Symbol 列中的基因名称，粘贴并保存到名为 OMIM.txt 的文件中。
3. PharmGkb 数据库
   注：PharmGkb （https://www.pharmgkb.org） 是药物基因组学知识库，包含药物标签注释、以药物为中心的通路、药物遗传学摘要以及基因、药物和疾病之间的关系²²。
   1. 转到 PharmGkb 网站界面。在搜索框中输入 osteoporosis，点击 Search，然后勾选左侧边栏中的 Gene 。
   2. 手动输入所有结果并将其保存到名为 PharmGkb.txt 的文件中。
4. TTD：治疗靶点数据库 （TTD） 数据库
   注：TTD 数据库 （https://idrblab.org/ttd/） 提供有关蛋白质和核酸靶点、靶向疾病、通路信息以及每个靶点的相应药物的信息²³。
   1. 转到 TTD Web 界面。在搜索框中键入 osteoporosis，然后单击 Search（ 搜索）。
   2. 点击 目标信息 下 目标ID，复制 目标名称，粘贴它，然后将其保存到名为 TTD.txt 的文件中。共获得 33 个结果。以相同的方式保存每个结果。
5. DrugBank Online （DrugBank） 数据库
   注：DrugBank 数据库 （https://go.drugbank.com） 包含有关药物和药物靶标、药物相互作用、药物机制和药物代谢的信息²⁴。
   1. 转到 DrugBank 网站界面。在搜索选项卡中选择 Indications（适应症 ），在搜索框中键入 osteoporosis（骨质疏松症），然后单击 Search（搜索）。
   2. 单击结果中的条目 Osteoporosis 了解更多信息，单击 DRUGS AND TARGETS 选项卡，然后单击表格 TARGET 列中的相应 链接 。
   3. 单击 Protein 中的 Details，复制 Gene Name，粘贴它，然后将其保存到名为 DrugBank.txt 的文件中。以相同的方式保存每个结果。

5. 维恩图

1. 疾病相关基因合并和 Venn 定位
   1. 将保存的 txt 文件和脚本放在同一文件夹中。
   2. 打开 R 代码 （Merge Disease-Related Genes），将上述 txt 文件的存储路径复制粘贴到 R 代码中 setwd 所在的行中。
   3. 打开 R 软件，运行修改后的 R 代码，然后保存。设置基因，将文件命名为 Disease.txt。
   4. 打开 Draw Venn Diagram 网站;在 输入 部分，将第 4 节到第 8 节中保存的文本内容逐个复制并粘贴到列表中，使用相应的数据库命名，然后单击 提交.
   5. 点击 将图像另存为 PNG 在图像下方，然后将文本结果保存在同一文件夹中。
2. 药物靶点与疾病相关基因的交集
   1. 将第 3 节中获得的 allTargets.symbol.txt 文件和步骤 5.1.3 中获得的 Disease.txt 文件放在同一个文件夹中。
   2. 打开 R 码（药物靶点和疾病相关基因走交集），将上述 txt 文件的存储路径复制粘贴到 R 码中 setwd 所在的行。
   3. 打开 R 软件，运行修改后的 R 代码，然后保存。设置基因，将文件命名为 Drug_Disease.txt。
   4. 打开 Draw Venn Diagram 网站。在输入部分中，将 allTargets.symbol.txt 和 Disease.txt 复制并粘贴到列表中，并在各自的文件后命名它们。
   5. 点击 将图像另存为 PNG 在图像下方，然后将文本结果保存在同一文件夹中。

6. 中药复配监管网络的构建

1. 将第 3 节中获得的 allTargets.symbol.txt 文件与 Disease.txt 文件和相应的 Perl 脚本（补充编码文件 3）放在同一文件夹中。
2. 打开 CMD，键入 cd 文件路径，按 Enter，然后运行 Perl 脚本。获取四个新的 txt 文件：net.geneLists.txt、net.molLists.txt、net.network.txt 和 net.type.txt。network.txt文件包含中药成分 ID、靶基因、靶关系和成分名称。net.type.txt 包含节点名称、属性和隶属关系。net.geneLists.txt 是基因列表，net.molLists.txt 是成分列表。
3. 将新获取的文本文件复制到同一个新文件夹中。
4. 打开 Cytoscape 3.9.1 软件，单击“文件”，单击“导入”，然后选择“网络格式文件”。选择 net.network.txt，将 Component ID 的第一列作为 Source Node，将 Genes 的第二列作为 Target Node，将 Targeting Relationship 的第三列作为 Interaction Type，然后单击 OK。
5. 从 Node Table （节点表） 窗口导入 net.type.txt。单击 Select 选项卡，选择 Nodes，选择 From ID List File，选择 net.geneLists.txt，然后单击 Open。
6. 单击 Layout 选项卡，选择 Degree Sorted Circle Layout，然后选择 Selected Nodes Only 。将节点的高度和宽度调整为 70。
7. 点击 高度 中的第二个框，在 列 中选择 degree.layout ，在 映射类型中选择 连续映射 ，双击 当前映射 右侧的 高度调整窗口 ，将高度的上下限调整到合适的范围。
8. 使用 Width 选项。
9. 再次单击 Layout 选项卡，然后单击 Layout Tools > 调整比例 ，以便节点不会重叠。
10. 单击软件 的右上方窗口 以取消选中节点网络，单击 “选择 ”选项卡，选择 “节点”，选择 “从 ID 列表文件”，选择 “net.molLists.txt”，然后单击 “打开”。
11. 单击 Layout 选项卡，选择 Group Attributes Layout，选择 Selected Nodes Only，然后单击 Type。
12. 单击左列中的 Label Font Size ，并将 Default Value 设置为 12。单击左列中的 Default Value in Image/Chart 1 。
13. 在弹出的窗口中选择 图表 ，单击 饼图，选择 可用列 列（程度除外） 的 项 数。Layout 并选择 columns 列，然后单击 Apply。
14. 点击 Border Paint 在左栏中，并将 Default Value 设置为 #003EF8。单击左侧边栏底部的 Edge 选项卡，并将 Width 设置为 0.8。
15. 点击 文件 在顶部工具栏上，选择 出口，然后选择 网络到图像.
16. 在弹出的窗口中，选择 PNG 格式 格式，选择 保存目录并命名图片网络，调整 放大图片大小 最大 500%，选择 透明背景，点击 OK 完成保存图片。

7. 蛋白质-蛋白质相互作用网络 （PPI） 构建体

1. 打开 STRING 网站（https://string-db.org/），单击“多种蛋白质”，单击“上传文件”中的 “浏览 ”，选择在步骤 5.2.3 中获得的 Drug_Disease.txt文件 ，然后选择 “ 生物体中的智人”。单击 Search 并单击 Continue。
2. 单击 Settings，将所需的最低交互分数设置为最高置信度 （0.900），然后在网络显示选项中选中 Hide Disconnected Nodes in the network 。单击 Update （更新）。
3. 对网络图中的节点进行调整，以便没有重叠或遮挡。
4. 单击 Exports 并单击 Download as a high-resolution bitmap 以获取 PNG 格式的蛋白质互通网络图。此外，将 TSV 文件下载为简短的表格文本输出。将两个文件保存在一个统一的文件夹中。TSV 文件包含基因名称、STRING 内部 ID 和不同属性的分数。

8. PPI 网络核心建设

1. 将第 7 节中获得的 TSV 文件和所需的 Perl 脚本放在一个新文件夹中。
2. 打开 Cytoscape 3.9.1 软件，单击 文件，选择 导入，单击 从文件访问网络，选择 上述 TSV 文件，将第一列 node1 作为源节点，将第二列 node2 作为目标节点，然后单击 确定。
3. 点击 样式 在左侧导航栏中，单击 默认值 in 宽度，并将其设置为 60。拖放节点，使网络中没有重叠和遮挡。
4. 单击顶部工具栏中的 APPS， 单击 CytoNCA，然后单击 Open。
5. 在左列中，选择中介、接近度、度、特征向量、基于局部平均连通性的方法和网络下的 无权重 ，然后点击 分析。
6. 分析完成后，单击右下窗口中的 Node Table ，单击 Export，将其保存到文件夹，并将其命名为 score 1。
   注意：CytoNCA 插件需要安装在 Cytoscape 软件中。为此，请单击顶部工具栏中的 Apps ，单击 APP Manager， 在搜索框中输入 CytoNCA，在返回结果的中间栏中选中 CytoNCA ，然后单击 Install。
7. 打开 score1，将 name 列调整为第一列，复制表中的信息，将其粘贴到新的文本文件中，将其命名为 score1.txt，然后保存。
8. 打开 R 代码，将 score1.txt 文件所在的路径复制并粘贴到 R 代码中 setwd 所在的行。
9. 打开 R 软件并运行修改后的代码以获取两个新文件，score2.txt 和 score2.gene.txt。score2.txt 文件包含所有程序分数都大于中位数的基因以及每个程序的特定分数。score2.gene.txt 包含所有项目的得分高于中位数的基因。
10. 要在 Cytoscape 中继续，请单击右下窗口中的 AnalysisPanel 1 ，单击窗口左侧的 Upload From File ，选择 score2.gene.txt，单击 Open，然后在弹出窗口中点按 OK 。
11. 单击底部的 Select Nodes ，然后在弹出窗口中单击 OK 。
12. 点击 文件 在顶部工具栏中，选择 出口，点击 网络到图像，调整 缩放 （%） 在 图像大小 到最大 500%，检查 透明背景，并将文件保存到同一个文件夹，命名为 network1。
13. 点击下方窗口右侧边栏中的 Create Sub-Network 创建子网络，分析子网络，点击顶部工具栏的 APPS ，点击 CytoNCA 并点击 Open。
14. 在左侧边栏中，选择 中介、接近度、度、特征向量、基于本地平均连通性的方法和网络下的 无权重 ，然后单击 分析。
15. 分析完成后，单击右下窗口中的 Node Table ，单击 Export，然后将其保存在名为 score2 的新文件夹中。
16. 打开 score2，将 name 列调整为第一列，复制表中的信息，粘贴到新的文本文件中，命名为 score2.txt，然后保存。
17. 打开 R 代码，将 score2.txt 文件所在的路径复制并粘贴到 R 代码中 setwd 所在的行。
18. 打开 R 软件并运行修改后的代码以获取两个新文件：score3.txt 和 score3.gene.txt。score3.txt 文件包含所有项目的得分高于中位数的基因以及每个项目的特定分数。score3.gene.txt 包含所有项目的得分高于中位数的基因。
19. 要在 Cytoscape 中继续，请单击右下角窗口中的 AnalysisPanel 1 ，单击窗口左侧的 Upload From File ，选择 score3.gene.txt，单击 Open，然后在弹出窗口中点按 OK 。
20. 单击底部的 Select Nodes ，然后在弹出窗口中单击 OK 。
21. 点击 文件 在顶部工具栏中，选择 出口，点击 网络到图像，调整 缩放 （%） 在 图像大小 到 500%，检查 透明背景，然后将文件保存在与此步骤中使用的文件夹相同的文件夹中，并将其命名为 network2。
22. 单击下面窗口右侧边栏上的 Create Sub-Network 以创建子网络。
23. 单击顶部工具栏中的 文件 ，选择 导出，单击 网络到图像，将图像大小的缩放 （%） 调整为最大 500%，选中 透明背景，然后将文件保存在与此步骤相同的文件夹中，并将其命名为 network3。

9. 基因 ID 转换

1. 将 Drug_Disease.txt 文件放在与所需代码文件相同的新文件夹中。
2. 打开 R 代码（补充编码文件 4），将 Drug_Disease.txt 文件所在的路径复制并粘贴到 R 代码中 setwd 所在的行。
3. 打开 R 软件，使用 org 运行修改后的代码。Hs.eg.db包来转换基因 ID，并在完成新文件id.txt后运行。id.txt包含基因的符号和相应的 ID。

10. GO 富集分析

1. 将上一步中id.txt文件与 GO 扩充分析代码放在同一文件夹中。
2. 打开 R 代码 （Supplementary Coding File 5） 并将工作目录设置为 id.txt 以及 GO 代码的存储路径。
3. 打开 R 软件，运行修改后的代码，并使用 clusterProfiler、org.Hs.eg.db，丰富绘图、ggplot2 图、GO 富集分析直方图和气泡图。运行完成后，获取三个新文件：GO.txt、barplot.pdf 和 bubble.pdf。
   注：GO.txt是富集结果文件，包含富集分类（BP、CC、MF）、GO ID、GO 名称、基因比例、背景比例、富集显著性 p 值、校正后的 p 值（p.adjust、值）、基因 ID（名称）和每个 GO 上富集的基因数。barplot.pdf 是直方图，气泡。PDF 是气泡图。

11. KEGG 富集分析

1. 将 id.txt 文件放在与 KEGG 富集分析代码相同的文件夹中。
2. 打开 R 代码 （Supplementary Coding File 6） 并将工作目录设置为 id.txt 和 KEGG 代码的存储路径。
3. 打开 R 软件，运行修改后的代码，然后使用 clusterProfiler org。Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2 软件包，用于绘制 GO 富集分析直方图、气泡图和通路图。运行完成，生成三个新文件：KEGG.txt、barplot.pdf 和 bubble.pdf。
   注：KEGG.txt 文件是一个富集结果文件，包含通路 ID、通路描述、基因比例、背景比例、富集显著性 p 值、校正后的 p 值（p.adjust、qvalue）、基因 ID（名称）和每个通路中富集的基因数。barplot.pdf 是条形图，bubble.pdf 是气泡图。
4. 在 KEGG.txt 文件中搜索 IL-17;结果表明，只有一条通路;复制通路 ID。
5. 打开 R 代码，将 IL-17 通路 ID 粘贴到 KEGGID 处，然后使用 pathview 包标记通路图。运行修改后的 R 代码并获取两个新文件：hsa04657.pathview.png 和 hsa04657.png。
   注意：hsa04657.png 文件是通路图，hsa04657.pathview.png 是标记的通路图，用红色标记的那些是存在于相互作用网络中的基因。

12. 逍遥丸的制备

注：有关所用的制备方法，请参阅中国药典⁵。

1. 取柴胡 100 克、当归 100 克、白芍 100 克、炒白术 100 克、茯苓 100 克、甘草 80 克和薄荷草 20 克。
2. 使用石磨或制粉机，将草药粉碎成细粉;将几种草药按上述比例混合并粉碎成细粉，自然混合在一起。使用内径为 180 μm ± 7.6 μm 的 80 目药筛，筛分粉碎的粉末。充分混合。
3. 取生姜 100 克，加水，每次煮 2 次，每次 20 分钟。过滤并放在一边。
4. 取药菌斑，将小扫帚蘸上姜水，刷在菌斑上，取上述粉末，撒在姜汁上，转动斑块，使粉末全部湿润，即可成型为球状。
   注意：药菌斑的形成是制备中药丸过程中必不可少的步骤。大部分毛竹会被劈成条状，编织成骨架。竹皮或 tengpi 被编织到表面，并变得圆润。斑块表面应薄薄地涂上桐油，然后刷上一层清漆。将其干燥以变得不透水。以这种方式制成的药丸将是圆润光滑的。
5. 再次刷上姜水，撒上粉末，旋转斑块，使药物逐渐变圆和扩大。置于阴凉处晾干。

13. 动物模型的建立

1. 适应 7 天后，将实验小鼠随机分为 4 组，即假手术组 （假手术组，仅去除卵巢周围的脂肪）和由模型组 （OVX） 组成的 3 组卵巢切除小鼠以及低浓度和高浓度逍遥丸给药组。
2. 用腹膜内注射 3% 戊巴比妥钠 （40 mg/kg） 麻醉小鼠。通过观察全身肌肉松弛、深呼吸和缓慢呼吸以及缓慢的运动来检查小鼠是否进入麻醉状态。手术前将眼膏涂抹在小鼠的眼睛上。
3. 将动物置于俯卧位，并用动物剃须刀剃掉背部的肾脏区域。用 75% 乙醇进行局部消毒。
4. 在靠近肾脏背侧区域的地方，在双侧做一个约 1 cm 的纵向切口，切开筋膜以分离肌肉和腹膜。
5. 找到子宫角的上部和输卵管进行结扎。将镊子插入切口进行探查，找到卵巢，被脂肪组织包裹在鲜红色的花椰菜图案中，卵巢下方有螺旋状排列的输卵管，将卵巢连接到子宫角²⁵。用手术剪刀和缝合线去除卵巢。
6. 去除卵巢附近的少量脂肪组织作为假手术组中的对照。观察动物，直到它们恢复意识。将术后动物放在不同的笼子中，直到完全恢复。
7. 为防止感染，术后给小鼠提供庆大霉素 3 天。手术后，根据小鼠的实际情况，保证正常的饮食和良好的生长环境。如果有任何异常，如伤口感染或食欲不振，请立即咨询实验动物中心的指导员。

14. 药物管理

注：根据药理学实验方法²⁶，所用人和动物剂量的换算为 9 克 70 公斤成人的逍遥丸，相当于一剂（单次给药的剂量）。

1. 对于低剂量组和高剂量组，一组 8 只动物分别使用 0.683 g/kg 和 2.73 g/kg。用左手固定鼠标，使鼠标的嘴与食管成一条直线。右手握住管饲针，从老鼠的嘴角沿着咽后壁轻轻插入食道。
2. 此时，管饲针的方向可能会略微改变以刺激诱导吞咽动作。注射药物。每天执行一次，持续 12 周。
3. 对于假手术组和模型组，每天一次服用生理盐水，持续 12 周，剂量由动物的体重决定。
4. 通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死并夹住它们的后肢。给四肢蒙皮，将肌肉与股骨分开。用 EDTA 脱钙溶液治疗小鼠股骨 1 个月，每天更换新鲜溶液。

15. 苏木精-伊红染色 （HE） 染色

1. 将股骨组织脱蜡 8 分钟，然后放入梯度乙醇中 3 分钟;用流水冲洗 1 分钟。
2. 将苏木精染色溶液滴加到切片中，以完全覆盖组织，染色 5 分钟，然后用自来水洗涤
3. 将盐酸分化液添加到载玻片上的组织中，确保其完全覆盖组织。当观察到组织变色时停止。用自来水冲洗。
4. 滴加曙红染料溶液，让其完全覆盖组织，作用 30 秒至 2 分钟。用流水冲洗多余的染料。
5. 用 75% 无水乙醇进行梯度乙醇脱水 5 分钟，然后用无水乙醇脱水 5 分钟，并使用脱蜡溶液澄清 3 分钟。
6. 根据组织的大小，在载玻片上滴入适量的中性胶，并小心放下盖玻片，避免气泡。

16. 显微 CT 和免疫组织化学分析

1. 从不同小鼠组去除股骨标本周围多余的肌肉和韧带，并将样品组织在 4% 多聚甲醛中固定 24 小时。
2. 风干骨组织，通过骨组织扫描进行显微 CT，以获得三维显微 CT 数据。
3. 从保存的小鼠蜡块中，将它们切成 6 μm 厚的连续切片，并在 70 °C -72 °C 下烘烤切片 30-60 分钟。
4. 脱蜡 8 分钟，然后用 75% 无水乙醇处理 5 分钟，用无水乙醇处理 5 分钟，用 PBS 冲洗 5 分钟，用 3 次。
5. 进行 EDTA 高压修复 15 分钟，然后 PBS 洗涤 5 分钟，持续 3 次。
6. 向组织中滴加 3% 过氧化氢，在室温下孵育 10 分钟，然后用 PBS 洗涤 5 分钟，持续 3 次。
7. 用免疫组化笔画一个圆圈。用 PBS 洗涤 3 分钟，持续 3 次。
8. 一抗（抗 ALP 兔 pAb （1：200）、抗 COL-1 兔 pAb （1：200）、抗 IL-17 兔 pAb （1：275）、抗 Act1 （1：500）、抗 IL-6 兔 pAb （1：500））染色过夜，然后 PBS 缓冲液冲洗 5 分钟，持续 3 次。
9. 滴加二抗（HRP 偶联的 Affinipure 山羊抗兔 IgG （H+L;1：2000））并在室温下孵育 60 分钟。用 PBS 缓冲液洗涤 3 分钟，每次 3 次。
10. 在 DAB 中即用型 3-5 分钟，然后用 PBS 冲洗。
11. 进行苏木精重新染色 3 分钟，然后进行 PBS 冲洗。
12. 使用分化溶液约 10 秒，然后进行 PBS 冲洗。
13. 加入返回蓝色溶液 10 秒，然后进行 PBS 冲洗。
14. 进行 75% 无水乙醇处理 5 分钟，无水乙醇处理 5 分钟，然后澄清 3 分钟。使用中性树脂密封载玻片。

结果

逍遥丸的活性成分和作用靶点
通过检索 TCMSP 数据库并根据口服生物利用度 （OB） ≥ 30% 和类药性质 （DL） ≥ 0.18 的标准进行筛选，发现小药丸中存在 125 种活性成分。其中，成分 6、4、9、13、2、6、83 和 2 分别来自白芍、白术、薄荷、柴胡、当归、茯苓、甘草和生姜。一些活性成分如表 1 所示。此外，从 TCMSP 数据库中共获得 879 个有?...

讨论

据统计，骨质疏松症在美国每年导致 150 万例骨折，其中绝大多数发生在绝经后妇女^{身上 27}。随着人口老龄化的增加，预计全球未来大部分髋部骨折将发生在亚洲，到 2050 年，全球髋部骨折总数将达到 820 万例²⁸。预防骨折的成本几乎等于治疗骨折的成本，使用药物不可避免地会产生一些副作用²⁹。因此，迫切需要一种更具成本效益的方法，在?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1ml Sampler	Guangxi Beilunhe Medical Industrial Group Co.	JYQ001	For anesthesia in mice
4%polyformaldehyde	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P1110	For tissue fixation
6-0 absorbable suture (angled needle)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.	HZX-06	For postoperative suturing
Absorbent cotton ball	Winner	MIANQIU-500g	For sterilization and hemostasis
Adhesive slides	Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co.	188105	For tissue sectioning
Amobarbital	Sigma Aldrich (Shanghai) Trading Co.	A-020-1ML	For anesthesia in mice
Bluing Solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1866	Blue coloration of the nuclei of cells after the action of hematoxylin differentiation solution
C57BL/6 mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	(SCXK 2033-0063)	For use in animal experiments
Carbon steel surgical blades	Premier Medical Equipment Co.	SP239	For mouse surgery
CIKS/TRAF3IP2 Rabbit pAb	BIOSS ANTIBODIES	bs-6202R	Binds to Act1 in tissues
Cole's Hematoxylin Solution (For Conventional Stain)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1140	For staining paraffin sections
Collagen Type I Polyclonal antibody	proteintech	14695-1-AP	Binds to COL-1 in tissues
DAB Substrate kit,20x	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	DA1010	For tissue color development
Disposable surgical sheet 50*60CM	Nanchang Xuhui Medical Equipment Co.	SP4529777	For mouse surgery
EDTA decalcification solution (pH 7.2)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	E1171-500ml	For tissue decalcification
Enhanced Endogenous Peroxidase Bloching Buffer	Beyotime Biotechnology	P0100B	Sequestration of tissue or cellular endogenous peroxidases
Environmentally friendly dewaxing clear liquid	Servicebio	G1128-1L	For dewaxing paraffin sections
Ethyl Alcohol	CHRON CHEMICALS	64-17-5 (CAS)	For dehydration of paraffin sections
General Purpose Antibody Diluent	Epizyme Biotech	PS119L	For antibody dilution
Hematoxylin Differentiation Solution	Servicebio	G1039-500ML	For differentiation after hematoxylin staining and removal of excessively bound and non-specifically adsorbed dye from tissues
Hematoxylin Eosin (HE) Staining Kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1120-3*100ml	For tissue staining
High quality stainless steel surgical knife handle	Premier Medical Equipment Co.	SP0088	For mouse surgery
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	proteintech	SA00001-2	Binds to primary antibody and amplifies signal
IL-17A Polyclonal antibody	proteintech	13082-1-AP	Binds to IL-17 in tissues
IL-6 Polyclonal antibody	proteintech	21865-1-AP	Binds to IL-6 in tissues
Immunohistochemistry pen	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.	ZLI-9305 (YA0310)	For drawing circles in immunohistochemistry
Medical surgical suture Non-absorbent (ball) 5-0 3.5m	Yangzhou Yuanlikang Medical Equipment Co.	FHX-5-2	For postoperative suturing
Medical Suture Needles Angle Needles 4*10 3/8	Chaohu Binxiong Medical Equipment Co.	FHZ612-4	For postoperative suturing
Neutral Balsam	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G8590	As a slice sealer
PBS(1X)	Shenzhen Mohong Technology Co.,Ltd	B0015	Buffer for slide washing and partial solution dilution
Protein Free Rapid Blocking Buffer (1X)	Epizyme Biotech	PS108P	Avoiding non-specific binding of proteins
Rabbit Anti-Bone Alkaline Phosphatase antibody	BIOSS ANTIBODIES	bs-6292R	Binds to alkaline phosphatase in tissues
Saline	Affiliated Hospital Youjiang Medical University For Nationalities	LHN500	For animals by gavage
Shaving/Electric clippers	HANGZHOU HUAYUAN PET PRODUCTS CO., LTD.	DTJ-002	For shaving mice
Stainless Steel Medical Needle Holder 14cm Coarse Needle	Premier Medical Equipment Co.	SP784	For mouse surgery
Stainless Steel Ophthalmic Forceps 10.5cm Curved (No Hook)	Zhuoyouyue	YKNWW-10.5	For mouse surgery
Stainless Steel Ophthalmic Scissors/Surgical Scissors 10CM Straight Tip	Premier Medical Equipment Co.	ZYJD-10-ZJ	For mouse surgery
Stainless Steel Tip Gastric Needle 12 Gauge 55mm Elbow		GWJ-12-55W	For use in mice by gavage
Tris-EDTA Antigen Repair Fluid (50x)	proteintech	PR30002	For antigen repair of paraffin sections
Wooden dissecting board 25*16cm		JP16*24	For mouse surgery
Xiaoyao pills	Jiuzhitang Co.,Ltd.	YPG-041	For animal drug delivery
Others
R 4.3.1			Data processing
Cytoscape3.9.1	National Resource for Network Biology		Building a regulatory network for traditional Chinese medicine
ImageJ 1.54f	National Institutes of Health		Image processing for immunohistochemistry results
Adobe Photoshop 24.0.0	Adobe		For image combination
GraphpadPrism 9.5	GraphPad Software		Statistical analysis of data
cellsens Dimension	OLYMPUS		For slicing and photographing
OLYMPUS BX53	OLYMPUS		For HE staining and immunohistochemical section photography