完整 果蝇 幼虫中的激光细胞消融揭示了突触竞争

摘要

该协议展示了完整 果蝇 幼虫中单个神经元的激光细胞消融。该方法能够研究减少发育中的神经系统中神经元之间竞争的效果。

摘要

该方案描述了在完整黑腹果蝇幼虫的中枢神经系统 （CNS） 中使用 2 光子激光系统进行单神经元消融。使用这种非侵入性方法，可以以细胞特异性方式操纵发育中的神经系统。破坏网络中单个神经元的发育可用于研究神经系统如何补偿突触输入的损失。在果蝇的巨纤维系统中，单个神经元被特异性消融，重点是两个神经元：突触前巨纤维 （GF） 和突触后尾转子运动神经元 （TTMn）。GF 与同侧 TTMn 突触，这对逃逸反应至关重要。在 GF 开始轴突生长后，消融第 3 龄大脑中的一个 GF，在 CNS 发育过程中永久去除细胞。剩余的 GF 与缺失的邻居发生反应，并与对侧 TTMn 形成异位突触末端。这种非典型的、双侧对称的末端支配两个 TTMns（如染料偶联所示），并驱动两个运动神经元（如电生理学测定所示）。总之，单个中间神经元的消融表明双侧神经元之间的突触竞争可以补偿一个神经元的损失并恢复对逃逸回路的正常反应。

引言

激光消融是解剖各种生物体神经回路的首选工具。它在蠕虫和苍蝇等模型遗传系统中开发，已应用于整个动物王国，以研究神经系统的结构、功能和发育 ^1,2,3。在这里，采用单神经元消融来研究神经元在果蝇回路组装过程中如何相互作用。果蝇的逃逸系统是最受欢迎的分析回路，因为它包含成年果蝇中最大的神经元和最大的突触，并且该回路在过去几十年中得到了很好的表征⁴。神经元-神经元相互作用在 Giant Fiber 电路的组装中的作用是本研究的重点。

自 1960 年代 Hubel 和 Wiesel 的工作以来，一种相互作用一直是神经科学的焦点，即“突触竞争”^5,6。在该协议中，激光消融用于重新审视通过单细胞消融在果蝇巨纤维系统 （GFS） 中的竞争作用，在那里可能会发现该现象的分子基础。

由于各种原因，包括可视化目标神经元、消融方法的精度以及标本的存活率，对发育中的果蝇中的神经元进行消融一直很困难。为了克服 GFS 中的这些问题，使用 UAS/Gal4 系统

研究方案

用于该方案的所有动物都属于黑腹果蝇物种。围绕该物种的使用不存在道德问题。开展这项工作不需要道德审查。材料表中列出了研究中使用的果蝇物种、试剂和设备的详细信息。

1. 培育 果蝇 并选择正确的幼虫阶段

1. 选择驱动待消融细胞表达的 Gal4 驱动系，并将其与 UAS-GFP 报告基因系重组或交叉。在 25 °C 的标准果蝇食物上饲养果蝇。
   注：对于巨纤维 （GF） 消融，R91H05-Gal4 或 A307-Gal4 与 UAS-GFP 重组。与 UAS-GFP 重组的 ShakB（致死）-GAL4 用于 TTMn 消融（参见 材料表）。
2. 选择已经开始从食物中出来并爬上食品瓶侧面的幼虫。这些幼虫处于游荡阶段，这是进行 GF 细胞消融的首选阶段。
   注意：消融可以在任何幼虫阶段进行。最后一个幼虫阶段对于操纵 GFS 的发育很重要，因为 GF 细胞体可以在大脑中很容易识别，但 GF 轴突在这个阶段还没有与其目标建立联系。

2. 准备^第 3 龄幼虫

注意：使用类似于 Burra ....

讨论

事实证明，使用 2 光子显微镜进行细胞消融是操纵 果蝇神经元回路发育的一种非常成功的方法。由于这种方法是非侵入性的，因此对动物造成的伤害最小。数据支持这种对已知电路的单元特异性操作的有用性。

消融成功的关键是选择最合适的 Gal4 驱动程序。由于 GFS 得到了很好的研究，因此已经描述了许多特定的 Gal4 驱动程序系列⁷。大多数 Gal4 驱动?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jaxkson ImmunoResearch	111-545-003
Anti-green fluorescent protein, rabbit	Fisher Scientific	A11122	1:500 concentration
Apo LWD 25x/1.10W Objective	Nikon	MRD77220	water immersion long working distance
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B4287-25G
Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser	Coherent
Cotton Ball	Genesee Scientific	51-101
Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby)	Fisher Scientific	D1817
Drosophila saline			recipe from Gu and O'Dowd, 2006
Ethyl Ether	Fisher Scientific	E134-1	Danger, Flammable liquid
Fly food B (Bloomington recipe)	LabExpress	7001-NV
Methyl salicylate	Fisher Scientific	O3695-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Eppendorf	22363204
Microscope cover-slip 18x18 #1.5	Fisher Scientific	12-541A
Neurobiotin Tracer	Vector Laboratories	SP-1120
Nikon A1R multi-photon microscope	Nikon		on an upright FN1 microsope stand
NIS Elements Advanced Research	Nikon		Acquisition and data analysis software
Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	T353-500
PBS (Phosphate Buffered Salin)	Fisher BioReagents	BP2944-100	Tablets
R91H05-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	40594
shakB(lethal)-GAl4	Bloomington Drosophila Stock Center	51633
Superfrost microscope glass slide	Fisher Scientific	12-550-143
Triton X-100	Fisher Scientific	422355000	detergent solution
UAS-10xGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	32185